一種適于牙鲆性腺冰凍切片mRNA原位雜交的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及mRNA原位雜交技術(shù)，具體的說(shuō)是一種適于牙鮮性腺冰凍切片mRNA原位 雜交的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牙鲆，俗稱牙片，為鲆鰈魚(yú)類，錄屬于鰈形目、牙鲆科、牙鲆屬，是我國(guó)和日韓等國(guó) 的重要海水養(yǎng)殖魚(yú)類。牙鲆具有雄魚(yú)比雌魚(yú)生長(zhǎng)快、個(gè)體大的特點(diǎn)，牙鲆已逐步在性別決定 與分化研究領(lǐng)域成為海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類模式物種，研究其性別決定與分化的機(jī)制，確定性別決 定與分化相關(guān)的基因，并以此為基礎(chǔ)，對(duì)其實(shí)施性別控制，具有重要的理論和實(shí)踐意義。通 過(guò)牙鲆性腺冰凍切片mRNA原位雜交可以解析性別決定和分化相關(guān)基因的表達(dá)模式及相互 關(guān)系，但由于直接進(jìn)行mRNA整體原位雜交非常困難，使得該技術(shù)難以應(yīng)用。因此建立牙鲆性 腺冰凍切片mRNA原位雜交的方法，對(duì)于牙鲆性別決定和分化相關(guān)規(guī)律的闡述具有重要的意 義;另外該發(fā)明在其它魚(yú)類性腺等組織的原位雜交進(jìn)行基因定位和功能研究方面將有一定 應(yīng)用前景，甚至可以開(kāi)發(fā)相關(guān)檢測(cè)試劑盒而進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明在于提供一種適于牙鲆性腺冰凍切片mRNA原位雜交的方法。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] -種適于牙鲆性腺冰凍切片mRNA原位雜交的方法：
[0006] 1)將牙鲆性腺依次經(jīng)過(guò)量濃度為4%PFA溶液固定和100%甲醇溶液通透，而后長(zhǎng) 期保存；固定后保存的樣品經(jīng)復(fù)水、20-30%蔗糖沉降后，進(jìn)行0CT包埋和冰凍切片，55°C干 燥2-3h，獲得冰凍切片作為原位雜交樣品；
[0007] 2)上述樣品經(jīng)過(guò)量DEPC水洗滌3-5min以除去樣品切片0CT包埋劑;洗滌、蛋白酶K 消化、固定而后經(jīng)預(yù)雜交，預(yù)雜交后與含有牙鲆RNA探針的雜交液混合于50-70°C下雜交過(guò) 夜；雜交處理后洗滌，并經(jīng)抗體孵育，再洗滌，避光顯色，終止顯色，再固定，封片，進(jìn)而實(shí)現(xiàn) 對(duì)牙鲆性腺相關(guān)基因在mRNA水平的表達(dá)定位。
[0008] 所述固定后樣品經(jīng)過(guò)量濃度100 %甲醇溶液洗滌后再用100 %甲醇溶液于-20°C長(zhǎng) 期保存。
[0009] 將原位雜交樣品經(jīng)過(guò)量DEPC水洗滌3-5min以除去0CT包埋劑;洗滌后用過(guò)量無(wú) RNA 酶的1 X PBST緩沖液洗滌反復(fù)洗滌，洗滌后加入蛋白酶K( 10μg/ml)于37 °C消化處理3-20min，消化處理后于過(guò)量濃度為4%PFA溶液再固定20-60min，固定后經(jīng)過(guò)量無(wú) RNA酶的1 X PBST緩沖液反復(fù)洗滌;洗滌后用PAP筆圈出樣品區(qū)域，使樣品與過(guò)量預(yù)雜交液于50-70 °C預(yù) 雜交2-5h。
[0010] 所述預(yù)雜交液為50(v)%去離子甲酰胺，25(v)%20XSSC(生工，中國(guó)），50μg/ml肝 素，500μg/ml酵母tRNA，0.1 (v) %Tween_20，1M的梓檬酸460μ1，加無(wú) RNA酶水定容至50ml。
[0011] 所述含有牙鲆RNA探針的雜交液是將用預(yù)雜交液稀釋RNA探針至終濃度為l-2ngAi 1，再將其置于80 °C變性30min，變性后，待用。
[0012] 所述探針為RNA探針，是以在性腺內(nèi)表達(dá)基因的cDNA為模板構(gòu)建探針載體，在體外 轉(zhuǎn)錄合成的帶有地高辛標(biāo)記的、并與該基因的核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一段單鏈cRNA分子。 其中，nr5a2、nr0bl、〇7口193、(11]11'1:1、;1；'(?12等性腺發(fā)育相關(guān)基因均可用來(lái)構(gòu)建并合成1?嫩探 針。
[0013] 所述預(yù)雜交后樣品與含有牙鲆RNA探針的雜交液混合于50-70°C下雜交過(guò)夜后于 50-70°C下依次預(yù)雜交液(不含肝素和酵母tRNA)快速漂洗一次(5-20min)、漂洗后用過(guò)量的 體積比為1:1的預(yù)雜交液(不含肝素和酵母tRNA)和2 X SSC混合液洗滌5-20min、再用過(guò)量2 X SSC洗滌10-30min、再用過(guò)量含0.1CHAPS的0.2 X SSC兩次洗滌，每次15-30min;最后在室 溫下用MAB溶液洗滌5-10min。
[0014] 所述MAB溶液為lOOmM馬來(lái)酸，150mM NaCl，pH7.5。
[0015] 所述雜交處理洗滌后，樣品用過(guò)量封閉液于室溫下水平搖床封閉2-4h，而后加入 堿性磷酸酶抗體在4°C孵育過(guò)夜，再洗滌，避光顯色，終止顯色，再固定，封片，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)牙 鲆性腺相關(guān)基因在mRNA水平的表達(dá)定位。
[0016] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 本發(fā)明在牙鲆中建立了冰凍切片mRNA原位雜交的方法來(lái)研究相關(guān)基因在性腺中 的表達(dá)模式，解決了性腺分化后期及成熟期性腺較大、直接整體原位雜交困難等問(wèn)題，將有 助于進(jìn)一步闡述牙鲆性別決定和分化的相關(guān)規(guī)律;另外該發(fā)明在其它魚(yú)類性腺等組織的原 位雜交進(jìn)行基因定位和功能研究方面將有一定應(yīng)用前景，甚至可以開(kāi)發(fā)相關(guān)檢測(cè)試劑盒而 進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的牙鲆nr 5a2基因在性腺中的冰凍切片mRNA原位表達(dá)的 示意圖。其中，nr5a2在卵巢發(fā)育第ΙΠ 期中的表達(dá)模式，短箭頭所指位置是濾泡細(xì)胞，長(zhǎng)箭頭 所指位置是卵母細(xì)胞。
[0019] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的牙鲆foxl2基因在卵巢中的冰凍切片mRNA原位表達(dá)的 示意圖。其中，f〇xl2在卵巢發(fā)育第m期中的表達(dá)模式，短箭頭所指位置是濾泡細(xì)胞，長(zhǎng)箭頭 所指位置是卵母細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例詳述本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)步驟。
[0021] 本發(fā)明解決了牙鲆性腺組織難于直接進(jìn)行性腺原位雜交的問(wèn)題，能夠清晰地描述 牙鲆相關(guān)基因在性腺中的表達(dá)定位(mRNA水平）；另外該發(fā)明在其它魚(yú)類性腺等組織的原位 雜交進(jìn)行基因定位和功能研究方面將有一定應(yīng)用前景，甚至可以開(kāi)發(fā)相關(guān)檢測(cè)試劑盒而進(jìn) 行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0022]實(shí)施例
[0023] 1.取樣，洗樣。剝離的牙鲆性腺樣品，用過(guò)量無(wú) RNA酶的1 XPBS緩沖液漂洗。
[0024] 2.固定。洗滌以后的性腺樣品置于無(wú) RNA酶離心管中，樣品與濃度為4%PFA的按體 積比為1:10的比例混合，顛倒混勻以后，平放于4 °C，固定12h。所述PFA由4g PFA溶解于 100ml無(wú) RNA酶的1 X PBS緩沖液得到。
[0025] 3.長(zhǎng)期保存。將上述固定后樣品用過(guò)量濃度100%甲醇溶液漂洗兩次，洗滌后置于 過(guò)量的濃度100%甲醇溶液中，置于_20°C長(zhǎng)期保存。
[0026] 4.冰凍切片。將上述長(zhǎng)期保存樣品經(jīng)體積比3: 2和2: 3的，濃度為100%甲醇和無(wú) RNA酶的1 X PBST緩沖液分別進(jìn)行復(fù)水處理10-30min;再用100 洗滌4次，每次5min。洗 滌后復(fù)水后樣品經(jīng)30%蔗糖的1XPBS沉降后，沉降后進(jìn)行0CT包埋，再冰切成14μπι的切片， 粘貼于原位雜交防脫載玻片上，于55°C干燥2h，獲得冰凍切片作為原位雜交樣品；
[0027] 所述無(wú) RNA酶的1 XPBST緩沖液成分為：136.89mM NaCl，2.67mM KCl，8.24mM Na2HP04，1 · 76mM KH2P04，0 · 1 (v) % Tween-20，由無(wú) RNA酶水配置，PH7 · 4。
[0028] 5.洗滌。將冰凍切片原位雜交樣品經(jīng)DEPC水洗滌5min以除去OCT包埋劑;洗滌后再 用過(guò)量無(wú) RNA酶的PBST緩沖液洗滌三次，每次5min。
[0029] 6.蛋白酶K消化。將上述洗脫后冰凍切片樣品用蛋白酶K(10μg/ml)于37°C處理 5min〇
[0030] 7.再固定。將上述消化后冰凍切片樣品用過(guò)量4 % PFA溶液漂洗一次，再用過(guò)量4 % PFA溶液于室溫水平搖床上再固定20min。
[0031] 8 .洗滌。固定后用過(guò)量的濃度100 %無(wú) RNA酶1 X TOST漂洗一次，再用過(guò)量的濃度 100 %無(wú) RNA酶1 X PBST洗滌三次，每次5min。
[0032] 9.預(yù)雜交。上述洗滌后冰凍切片樣品按照每原位雜