一種L-天冬氨酸β-脫羧酶產(chǎn)生菌的高通量篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物制藥領(lǐng)域，涉及一種L-天冬氨酸β_脫羧酶產(chǎn)生菌的高通量篩 選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-天冬氨酸β -脫羧酶（Asd)，又稱L-天冬氨酸1-脫羧酶，能催化脫去L-天冬 氨酸的羧基，生成L-丙氨酸（L-Ala)。L-丙氨酸在醫(yī)藥和食品工業(yè)上的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，隨 著需求量的增加和發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展，L-丙氨酸的生產(chǎn)方法由蛋白質(zhì)水解提取法、發(fā)酵法發(fā) 展到酶法生產(chǎn)，即利用L-天冬氨酸β -脫羧酶將L-天冬氨酸脫羧生成L-丙氨酸。用Asd 轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-Ala可分為游離細(xì)胞法和固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。日本已經(jīng)在1982年用卡拉膠固 定Pseudomonas, dacunhae細(xì)胞用于L-Asp連續(xù)生產(chǎn)L-Ala。國內(nèi)劉景晶等（參見高麗娟等 人于2007年在《工業(yè)微生物》37 (5) :54-59中發(fā)表的文章）用卡拉膠固定含有Asd活性的 Pseudomonas, dacunhae 細(xì)胞，在 ρΗ6· 2 ~ρΗ7· 25 范圍內(nèi)和底物濃度為 0· 4mol/L_0. 5mol/L 時，固定化細(xì)胞表現(xiàn)出最高酶活力。
[0003] 然而在L-丙氨酸酶法轉(zhuǎn)化過程中，脫羧反應(yīng)使反應(yīng)液pH值不斷上升，偏離了酶反 應(yīng)的最適pH值范圍，導(dǎo)致細(xì)胞的酶活力降低，這對工藝過程控制和生物反應(yīng)器提出更高要 求。由于海洋微生物具有陸生微生物無法比擬的生態(tài)群落結(jié)構(gòu)多樣性和物種多樣性，所以 從海洋環(huán)境中篩選具有特殊耐受性質(zhì)的生物酶產(chǎn)生菌是目前微生物領(lǐng)域研究的特點(diǎn)，本發(fā) 明基于該理念，建立了從海洋生境中快速篩選L-天冬氨酸β -脫羧酶的高通量方法，并且 篩選的菌株具有耐堿性能，在細(xì)胞生產(chǎn)過程中避免了繁瑣pH值控制步驟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種L-天冬氨酸β -脫羧酶產(chǎn)生菌的高通量篩選方法。
[0005] 本發(fā)明所提供的L-天冬氨酸β -脫羧酶產(chǎn)生菌的高通量篩選方法，具體而言，可 包括如下步驟：
[0006] 1)采用富集培養(yǎng)基對樣品中的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)與初步分離；
[0007] 2)將步驟1)分離得到的單菌落穿刺接種微孔板初篩半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后根據(jù) 培養(yǎng)基的渾濁程度篩選L-天冬氨酸β -脫羧酶產(chǎn)生菌；
[0008] 3)將步驟2)初篩得到的菌株接種微孔板液體培養(yǎng)，收集菌體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，采用 紙層析法分析生成的L-丙氨酸含量，得到L-天冬氨酸β -脫羧酶高產(chǎn)菌株；
[0009] 4)將步驟3)復(fù)篩得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，收集菌體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，然 后氧化顯色法測定L-天冬氨酸β -脫羧酶酶活性。
[0010] 在上述方法中，步驟1)中，所述微生物樣品來自海綿、珊瑚、海底淤泥，所述富集 培養(yǎng)基含有質(zhì)量百分含量1 % _2 %的NaCl ;
[0011] 步驟2)中，所述初篩半固體培養(yǎng)基含有質(zhì)量百分含量0. 05 %的CaCl2 ;
[0012] 步驟3)中，所述生物轉(zhuǎn)化的操作方式為：將步驟2)初篩得到的菌株接種到復(fù)篩 培養(yǎng)基，20°C -37°C恒溫培養(yǎng)后離心收集菌體，與生物轉(zhuǎn)化液混合，混合物20°C -37°C孵育 12-24小時；
[0013] 步驟4)中，所述生物轉(zhuǎn)化的操作方式為：將步驟3)復(fù)篩得到的菌株接種到搖瓶發(fā) 酵培養(yǎng)基，20°C -37°C恒溫培養(yǎng)后離心收集菌體，與生物轉(zhuǎn)化液混合，混合物20°C -37°C孵 育12-24小時；
[0014] 在上述方法中，步驟1)中所述富集培養(yǎng)的方式為：將微生物樣品用富集培養(yǎng)基洗 滌三次，然后接種到富集培養(yǎng)基，溫度20°c -37°c、轉(zhuǎn)速100-200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)2-4天； 所述富集培養(yǎng)基各組分的質(zhì)量百分含量為：牛肉膏0. 5%，蛋白胨1%，酵母粉0. 2%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，NaCl 1. 5%，pH 8. 5-9. 0。
[0015] 步驟3)中，所述復(fù)篩培養(yǎng)基各組分的質(zhì)量百分含量為：葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵 母粉 0· 2%，NaCl 1. 5%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，MgS04 · 7H20 0· 03%，CaCl2 0· 05%，pH8. 5-9. 0。
[0016] 步驟4)中，所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基各組分的質(zhì)量百分含量為：葡萄糖3%，蛋白胨 1%，酵母粉 0.2%，NaCl 1.5%，ΚΗ2Ρ04 0 . 05%，Κ2ΗΡ04·Η20 0.14%，MgS04*7H20 0.03%， CaCl20. 05%, pH 8. 5-9. 0〇
[0017] 步驟3)與步驟4)中，所述生物轉(zhuǎn)化液各組分的質(zhì)量百分含量為：L-天冬氨酸 2%，ΚΗ 2Ρ040· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，ρΗ8· 5-9. 0。
[0018] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種L-天冬氨酸β-脫羧酶產(chǎn)生菌的初篩半固體 培養(yǎng)基。所述初篩半固體培養(yǎng)基各組分的質(zhì)量百分含量為：L-天冬氨酸2%，葡萄糖3%， 蛋白胨 1%，酵母粉 0.2%，NaCl 1.5%，ΚΗ2Ρ04 0 . 05%, Κ2ΗΡ04·Η20 0.14%，MgS04*7H20 0. 03%，CaCl2 0. 05%，瓊脂0. 8%，pH8. 5-9. 0 ;將所述初篩半固體培養(yǎng)基分裝于96孔酶標(biāo) 板，制得初篩半固體培養(yǎng)基孔板。
[0019] 所述初篩半固體培養(yǎng)基在對耐堿L-天冬氨酸β-脫羧酶產(chǎn)生菌的高通量篩選中 的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 本發(fā)明提供的L-天冬氨酸β -脫羧酶產(chǎn)生菌高通量篩選方法，可以用于快速篩選 具有耐堿性能的L-天冬氨酸β -脫羧酶產(chǎn)生菌，以解決酶法生產(chǎn)L-A la過程中pH值不斷 上升酶活性降低的問題，省略工藝過程不斷調(diào)節(jié)pH值步驟；該高通量篩選方法填補(bǔ)了目前 國內(nèi)在該方面研究的空白，同時也為同類生物酶產(chǎn)生菌的高通量篩選提供參考。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑 等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑購買。
[0022] 實(shí)施例1 L-天冬氨酸β -脫羧酶產(chǎn)生菌的篩選
[0023] -、樣品中微生物的富集與分離
[0024] 富集培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母粉0.2%，ΚΗ2Ρ04 0 . 05%，Κ2ΗΡ04·Η20 0· 14%，NaCl 1· 5%，pH 7· 0-7. 2,121°C滅菌 20min，冷卻后備用；
[0025] 分離培養(yǎng)基平板：牛肉膏0.5%，蛋白胨l%，NaCl 1.5%，瓊脂2%，pH 8.5-9. 0， 121°C滅菌20min，然后倒平皿制作分離平板，20mL/皿，冷卻凝固后待用；
[0026] 1、采樣
[0027] 文獻(xiàn)報(bào)道海洋微生物具有陸生微生物無法比擬的生態(tài)群落結(jié)構(gòu)多樣性和物種多 樣性，故選取了煙臺黃海海域作為采樣地點(diǎn)，采集了海綿、珊瑚、海底淤泥等共10個樣品。
[0028] 2、富集
[0029] 樣品取回實(shí)驗(yàn)室后，將樣品用100mL富集培養(yǎng)基洗滌三次，然后置于1000mL無菌 三角瓶中，溫度30°C、轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)3d，該步驟可將樣品中的微量微生物進(jìn)行 富集培養(yǎng)。
[0030] 3、平板分離
[0031] 將富集后的菌液用無菌生理鹽水十倍梯度稀釋后涂布分離培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng) 3d，作為篩選L-天冬氨酸β -脫羧酶產(chǎn)生菌的菌種資源庫。
[0032] 二、96微孔板穿刺培養(yǎng)初篩
[0033] 1、初篩培養(yǎng)基孔板的制備
[0034] 初篩半固體培養(yǎng)基配方：L-天冬氨酸2%，葡萄糖3%，蛋白胨1 %，酵母粉0. 2%， NaCll. 5%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · Η20 0· 14%，MgS04 · 7Η20 0· 03%，CaCl2 0· 05%，瓊脂 0. 8%, pH 8. 5-9. 0〇
[0035] 將初篩半固體培養(yǎng)基121°C滅菌20min，冷卻至50°C左右，然后采用96孔酶標(biāo)板制 備初篩培養(yǎng)基孔板，即向酶標(biāo)板的每個微孔中加入300 μ L初篩培養(yǎng)基，冷卻凝固后備用。
[0036] 2、穿刺培養(yǎng)初篩
[0037]用無菌牙簽從步驟一涂布的分離平板中逐個挑取單菌落，穿刺接種初篩培養(yǎng)基孔 板，總共接種480株，30°C培養(yǎng)16h，觀察微孔中培養(yǎng)基的透明度，L-天冬氨酸β -脫羧酶產(chǎn) 生菌所在的微孔培養(yǎng)基變渾濁，根據(jù)渾濁程度判定L-天冬氨酸β -脫羧酶的活性。
[0038] 其實(shí)驗(yàn)原理為：穿刺菌株所產(chǎn)生的L-天冬氨酸β-脫羧酶作用于培養(yǎng)基中的 L-天冬氨酸，脫羧產(chǎn)生的C02，在半固體培養(yǎng)基中呈離子態(tài)C032，C0 32與培養(yǎng)基中的Ca2+反 應(yīng)生成難溶的CaC03，可使培養(yǎng)基變渾濁，故可根據(jù)渾濁程度粗略判定L-天冬氨酸β -脫羧 酶的活性，該法快速簡捷，可在96微孔板中實(shí)現(xiàn)高通量的初篩。
[0039] 本實(shí)施例選取了 24株渾濁度較高的菌株，進(jìn)入下一步的復(fù)篩。
[0040] 三、24孔板液體培養(yǎng)結(jié)合紙層析復(fù)篩
[0041] 1、復(fù)篩培養(yǎng)基孔板的制備
[0042] 復(fù)篩培養(yǎng)基配方：葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵母粉0. 2%，NaCl 1.5%，ΚΗ2Ρ04 0· 05 %，Κ2ΗΡ04 · Η20 0· 14 %，MgS04 · 7Η20 0· 03 %，CaCl2 0· 05 %，ρΗ8· 5-9. 0。
[0043] 將復(fù)篩培養(yǎng)基121°C滅菌20min，冷卻后向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個微孔中加入 500 μ L復(fù)篩培養(yǎng)基即得復(fù)篩培養(yǎng)基孔板。
[0044] 2、生物轉(zhuǎn)化
[0045] 生物轉(zhuǎn)化液：L-天冬氨酸 2%，ΚΗ2Ρ04 0· 05