暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種的培養(yǎng)方法， CN101491195A)。
[0039] Ml淀粉固體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200.0g(煮汁），葡萄糖10.0g，酵母膏2.0g， MgS〇4 · 7H201 · 0g，KH2P〇4l · 0g，水 1000ml，瓊脂粉 15g，可溶性淀粉2g。
[0040] Ml淀粉剛果紅固體培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200.Og(煮汁），葡萄糖10.0g，酵母膏2.0g， MgS〇4 · 7H20 1 · 0g，KH2P〇4l · 0g，水 1000 · 0ml，瓊脂粉15 · 0g，可溶性淀粉2 · 0g，剛果紅2 · 0g。 [0041 ] 二、菌落生長實驗
[0042]將測試菌株在Ml固體培養(yǎng)基上活化，30°C避光培養(yǎng)20天，用直徑為lcm的無菌打孔 器在生長旺盛的菌絲前緣打孔取菌餅，接種于Ml培養(yǎng)基中央，30 °C避光培養(yǎng)。每個培養(yǎng)皿中 央只接種一個菌餅，每種處理至少做5個平行處理。分別于培養(yǎng)后第3、6、9、12、15和18天利 用十字交叉法測量菌落直徑，觀察菌落形態(tài)特征（吐水情況，菌核情況）。利用Microsoft EXCEL中的SLOPE函數(shù)求出菌落生長速率(v): v = 1/2*SL0PE ({菌落平均直徑集合}，{測量時 間集合})，其中菌落半徑單位為mm，測量時間單位為d，則生長速率單位為mm/d。例如，第11 天測量菌落直徑為dl，第t2天測量菌落直徑為d2，第t3天測量菌落直徑為d3，第t4天測量菌 落直徑為d4,......，則v=l/2*SL0PE( {dl，d2，d3，d4,......}，{tl，t2，t3，t4，......})。具體以 某次測量結(jié)果為例：tl = 3，t2 = 6，t3 = 9，t4 = 12，t5 = 15;dl = 10.41，d2 = 16.62，d3 = 23.93,(14 = 32.21，d5 = 41.39;貝lJv=l/2*SL0PE({ 10.41,16.62,23.93,32.21,41.39}，{3， 6，9,12,15}) = 1/2*2.59 = 1.29(mm/d)。5次及以上平行實驗的菌落生長速率的算數(shù)平均值 ±標準差表示平均生長速率，例如某菌株某次試驗中，5個平行實驗菌落生長速率分別為： 2.31，2.94,2.81，2.90,3.15 (mm/d)，則該菌株該次實驗平均生長速率=2 · 82 ± 0 · 28 (mm/ d) 〇
[0043] 菌落形態(tài)相關(guān)結(jié)果見表1和圖1。
[0044] 表1菌落生長實驗結(jié)果
[0045]
[0046] 不同小寫字母表示處理間的差異達到極顯著水平(ρ<0.01)，吐水及菌核情況為 菌絲接近長滿平板時觀察結(jié)果。
[0047] 由表1和圖1可知，菌種隨著繼代次數(shù)的增多，其菌落的吐水和菌核形成能力均減 弱。栽培優(yōu)良菌株11023、13013平均菌落生長速率與其他3個菌株有極顯著性差異。菌株Α、Β 菌落生長速率極顯著差異于菌株C。隨著繼代次數(shù)增多，菌落生長速率變化率2 10%。如與 菌株第一代原種相比，傳代5次后的菌株Β，生長速率變化率為（1.83-1.60)/1.83 = 12%。 [0048] 三、淀粉變色圈實驗
[0049] 剛果紅法:按上述接種方法將菌餅接種于Ml淀粉剛果紅固體培養(yǎng)基中，30°C避光 培養(yǎng)。第15天用十字交叉法測量菌落直徑和變色圈直徑。數(shù)據(jù)五個及以上平行試驗的平均 值土標準差表示。
[0050] 盧戈氏碘液法：按上述接種方法將菌餅接種于Ml淀粉固體培養(yǎng)基中，30 °C避光培 養(yǎng)。第15天用十字交叉法測量菌落直徑，然后用盧戈氏碘液染色(5.0g碘和10.0g碘化鉀溶 于85.0ml蒸餾水中，碘的總濃度為150mg/ml)用噴壺噴灑于培養(yǎng)基表面，測量未被染成藍色 區(qū)域的直徑。數(shù)據(jù)以五個及以上平行試驗的平均值土標準差表示。
[0051 ]相關(guān)實驗結(jié)果見表2。
[0052]表2淀粉變色圈實驗結(jié)果
[0053]
[0054] 不同小寫字母表示處理間的差異達到顯著水平(p<0.05)。
[0055] 淀粉變色圈實驗結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明暗褐網(wǎng)柄牛肝菌分泌了淀粉酶，且隨著 繼代次數(shù)增加，變色圈直徑與菌落直徑之比下降，即相同面積的菌落分泌淀粉酶能力降低， 淀粉酶分泌能力發(fā)生了退化。與第一代原種相比，剛果紅法測定變色圈直徑/菌落直徑的比 值降低幅度2 10%，盧戈氏碘液法測定變色圈直徑/菌落直徑的比值降低幅度2 5%。
[0056] 四、可溶性蛋白分析
[0057] 用直徑為lcm無菌打孔器在生長旺盛的菌絲前緣打孔取菌餅四個，接種于裝有 200ml Ml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，150rpm，30°C避光振蕩培養(yǎng)7d，無菌紗布過濾，蒸餾 水清洗3遍，用紗布擠去水分，液氮研磨至粉碎，立即稱取1 OOmg研磨物至pH為7.2的磷酸鹽 緩沖液中振蕩混勻，12000rpm離心1 Omin，小心吸取上清液即為蛋白樣品。用改良型 Bradford法蛋白濃度測定試劑盒對蛋白樣品進行定量，通過濃縮或者稀釋使得不同樣品 (測試菌種以及該菌種對應(yīng)的第一代原種)蛋白濃度保持一致。
[0058]使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)進行可溶性蛋白分析:濃縮膠濃度為 5%，分離膠濃度為10%，SDS濃度為0.1%，測試樣品以及該菌株對應(yīng)第一代原種的蛋白樣 品以相同體積相同蛋白質(zhì)濃度在同一塊膠上樣，上樣量為20μ1，電泳電壓為濃縮膠80V、分 離膠150V;溴酚藍迀移至離下端邊緣lcm左右停止電泳。按常規(guī)方法進行考馬斯亮藍染色。 根據(jù)所得電泳圖譜，計算有差異蛋白條帶的相對迀移率，計算公式為相對迀移率(Rf)=目 標蛋白條帶迀移距離/溴酚藍迀移距。根據(jù)蛋白Marker的相對分子量以及各個條帶的相對 迀移率，Excel數(shù)據(jù)擬合獲得相對迀移率和蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準曲線。獲得標準曲線 為：]? = -44.540111(1^) + 14.124，1?2 = 0.998;18]\1 = -0.8711^+2.093，1?2 = 0.993。]\1相對分子 量，單位kDa。
[0059] 實驗結(jié)果見圖2。結(jié)果表明菌株C可溶性蛋白在相對迀移率Rf = 0.56,相對分子量 為40.0 kDa的蛋白條帶相對于菌株A和B亮度降低，菌株B，C可溶性蛋白在Rf = 0.84分子量為 22. OkDa，條帶相對于菌株A亮度增強。
[0060] 五、酯酶同工酶分析
[0061] 用直徑為lcm無菌打孔器在生長旺盛的菌絲前緣打孔取菌餅四個，接種于裝有 200ml Ml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，150rpm，30°C避光振蕩培養(yǎng)7d，無菌紗布過濾，蒸餾 水清洗3遍，用紗布擠去水分，液氮研磨至粉碎，立即稱取100mg研磨物至pH為5.6的磷酸鹽 緩沖液中振蕩混勾，12000rpm離心10min，小心吸取上清液即為樣品。使用非變性聚丙稀酰 胺凝膠電泳(Native-PAGE)，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為8%，測試樣品以及該菌株對 應(yīng)第一代原種的蛋白樣品以相同體積相同蛋白質(zhì)濃度在同一塊膠上樣，上樣量為20μ1，濃 縮膠80V，分離膠150V，溴酚藍迀移至距端邊緣lcm左右時停止電泳。電泳結(jié)束前半小時進行 染色液、固定液和保存液的配制(郭曉霞.蝴蝶酯酶同工酶的系統(tǒng)學(xué)研究(鱗翅目、蝶亞目） [D]:陜西師范大學(xué)，2000)。電泳結(jié)束后將膠取出，去掉濃縮膠，用蒸餾水清洗后，放入染色 液，37°C染色，觀察著色情況，有清晰條帶出現(xiàn)時停止染色。取出凝膠，蒸餾水漂洗干凈后置 于固定液中過夜，第二天拍照并放入保存液中保存。
[0062] 根據(jù)所得圖譜，計算相對迀移率(Rf)，計算方法同可溶性蛋白分析的相對迀移率 計算方法。根據(jù)蛋白Marker的相對分子量以及各個條帶的相對迀移率，Excel數(shù)據(jù)擬合獲得 相對迀移率和蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準曲線。獲得標準曲線為：M =-69.1641n (R