一種飼用蠶絲抗菌肽制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物飼料添加劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種飼用蠶絲抗菌肽制劑及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 新華網(wǎng)在2015年11月23日報道，最近在牲畜和人身上發(fā)現(xiàn)了一種能對抗強效抗生 素的"超級細(xì)菌"基因，這意味著人類所用抗生素中的"最后一道防線"有被攻破的風(fēng)險。研 究人員分析豬肉、雞肉以及人類患者身上采集的細(xì)菌樣本發(fā)現(xiàn)，存在一種特殊基因 MCR-1， 攜帶該基因的細(xì)菌對多粘菌素表現(xiàn)出強耐藥性，并且這種耐藥性還能夠快速轉(zhuǎn)移至其他菌 株。
[0003] 中國由于濫用各種抗生素、激素和違禁藥品飼喂畜禽，而導(dǎo)致食品安全事件頻發(fā)， 畜禽肉制品對外出口連年下降，我國豬肉、禽肉、禽蛋、肉類總產(chǎn)量均占世界首位，而出口總 量僅占世界肉類出口總量3.6%，由于動物飼養(yǎng)方面仍然存在衛(wèi)生安全問題，歐盟、美國、日 本等發(fā)達(dá)國家至今未解除對我國動物源型食品進(jìn)口限制?？梢婇_發(fā)高效優(yōu)質(zhì)的生物飼料產(chǎn) 品替代抗生素、激素，生產(chǎn)綠色無公害、有機肉、蛋、奶是國家和全民食品安全需要的民生問 題。
[0004] 近幾年來，人們研究開發(fā)出了飼用酶制劑、飼用微生物制劑、酸化劑、抗菌肽、寡聚 糖、大蒜素、中草藥以及有機金屬微量元素等抗生素替代品，這些綠色飼料添加劑得到了人 們的青睞，都是基于抑制有害菌增殖、促進(jìn)有益菌增殖、改善腸道微環(huán)境的基礎(chǔ)上進(jìn)行研究 的，但總體來說，這些抗生素替代產(chǎn)品相對于抗生素而言，其作用效果仍有一定的差距。
[0005] 各種動物及家禽自幼小個體發(fā)育開始，體內(nèi)就建立起平衡的微生物菌群，并有其 維持自身菌群穩(wěn)態(tài)的機制，例如抗氧化因子、激素、蛋白、小肽等是維持機體微環(huán)境穩(wěn)定的 重要因子。
[0006] 抗菌肽是1980年由瑞典科學(xué)家G. Boman等人在蠶絲中分離得到的一類具有抗菌活 性的堿性多肽物質(zhì)，分子量在2000~7000左右，由20~60個氨基酸殘基組成。這類活性多肽多 數(shù)具有強堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點。本發(fā)明以天然蠶絲為原料，通過先進(jìn)的工藝 設(shè)計保證了抗菌肽的活性及穩(wěn)定性，項目最終獲得具有抗細(xì)菌、抗霉菌、抗氧化等活性的綠 色、健康、無耐藥性、環(huán)境友好、可代替飼料用抗生素的產(chǎn)品，從而達(dá)到更好的預(yù)防和治療畜 禽疾病的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種簡便的蠶絲抗菌肽的制備工藝，客服現(xiàn)有霉菌毒素吸附 劑效果片面吸附霉菌毒素以及因使用抗生素帶來的抗生素污染問題。
[0008] 為了上述目的，本發(fā)明實施的技術(shù)方案如下： 所述可以產(chǎn)生抗菌效果的抗菌肽，是由從桑蠶養(yǎng)殖戶收購的廢蠶絲作為抗菌肽制備的 原料。
[0009] 所述抗菌肽制備工藝方法如下： (1) 廢蠶絲的預(yù)處理，稱取一定量廢蠶絲，利用碳酸鈉溶液對蠶絲進(jìn)行脫膠處理，以碳 酸鈉溶液濃度、固液比和精煉時間作為廢蠶絲預(yù)處理的影響因素，以脫膠率作為實驗的考 察指標(biāo)。
[0010] 所述步驟（1)碳酸鈉溶液濃度為〇 · 2%-0 · 6%，固液比為1:30-1:70(g/mL)，脫膠時間 30-60min〇
[0011] 所述步驟（1)脫膠率，計算方法以采用烘干稱重法測定處理前后試樣的質(zhì)量，分 別將未脫膠和已脫膠的絲素樣品放入烘箱中，以（65±1) °C的溫度將其烘至恒重，并放入 干燥器中進(jìn)行冷卻，在室溫下穩(wěn)定12 h后用電子天平分別稱質(zhì)量，即得脫膠蠶絲和未脫膠 蠶絲的干重，分別以施和此表示。脫膠率公式如下：
式中:Mi表示脫膠蠶絲干重，112未脫膠蠶絲干重 (2) 將步驟（1)所得到的脫膠蠶絲，采用氯化鈣溶液溶解，溶解后的蠶絲采用超濾膜對 其進(jìn)行超濾脫鹽處理。
[0012 ] 所述步驟(2沖氯化鈣溶液濃度為20%、30%、40%、50%，所使用的超濾膜為MWC01000 超濾膜。
[0013] (3)對步驟(2)分離得到的脫鹽處理的脫膠蠶絲，采用堿性蛋白酶(Alcalase2.4L) 和風(fēng)味蛋白酶(Flavorzyme)進(jìn)行水解。
[0014] 所述步驟(3)中使用的復(fù)合蛋白酶配比為1:1 -1: 3，控制底物濃度3%_5%、加酶量 1%-2.5%、pH8-9、反應(yīng)溫度45 °C-65 °C、酶解時間2.5h-6.5h。本發(fā)明采用半微量凱氏定氮法 與甲醛法滴定氨基態(tài)氮聯(lián)合測定蠶絲抗菌肽的得率。
[0015] (4)對步驟(3)經(jīng)過酶水解得到的蠶絲抗菌肽溶液進(jìn)行分離純化，將蠶絲酶解液置 于的透析袋中對純水透析，主要是利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開，透析 結(jié)束后，再用聚乙二醇6000濃縮至原體積的1/5，收集備用，即為蠶絲中的多肽物質(zhì)。
[0016] (5)采用飽和的硫酸銨溶液沉淀步驟(4)制備的蠶絲多肽物質(zhì)，得到蠶絲抗菌肽沉 淀。
[0017] (6)采用氯化鈣溶解蠶絲抗菌肽沉淀，采用超濾膜過濾脫鹽濃縮蠶絲抗菌肽。
[0018]所述步驟(6)使用的超濾膜為MWC01000膜。
[0019] (7)經(jīng)濃縮過的蠶絲抗菌肽用離子交換層析和葡聚糖凝膠層析進(jìn)行分離純化，采 用考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行跟蹤檢測，收集洗脫液。
[0020] 所述步驟（7)采用DEAE-52纖維素對蠶絲抗菌肽進(jìn)行初步的分離純化，采用 Sephadex -G25凝膠柱層析進(jìn)行進(jìn)一步的純化處理， (8)合并步驟(7)收集的洗脫峰洗脫液，并按照洗脫峰的順序依次編號，預(yù)凍處理后，采 用真空冷凍干燥機干燥，即得蠶絲抗菌肽粉末。
[0021 ] 所述步驟(8)洗脫液厚度液位高度控制在0.5-1 cm，洗脫液預(yù)凍溫度為(-15°〇-(_ 18°C )，真空干燥機真空度為0.05MPa-0.08MPa，按照0°C-50°C程序降溫，干燥時間12-24h。 [0022] (9)本發(fā)明提供了一種蠶絲抗菌肽制劑的分離制備方法，工藝采用酶法水解脫膠 蠶絲，制備過程環(huán)境溫和，分離過程綠色環(huán)保，減少了因是由有機試劑帶來的環(huán)境污染和能 源動力消耗，采用本工藝分離制備的蠶絲抗菌肽可以應(yīng)用到飼料行業(yè)，因蠶絲抗菌肽具有 抗菌性能，所以可以在作為抗菌成分替代飼料添加劑中抗生素成分，所以本發(fā)明提供的蠶 絲抗菌肽產(chǎn)品的制備工藝將具有良好的發(fā)展前景。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明蠶絲抗菌肽制備工藝流程圖。
[0024]圖2是本發(fā)明DEAE-52離子交換層析柱層析梯度洗脫曲線圖（柱子規(guī)格：20mm* 65cm)
[0025] 圖3是本發(fā)明SAP-1組分Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱層析洗脫曲線圖（柱子規(guī)格 規(guī)格：l6mm*100cm)
[0026] 圖4是本發(fā)明蠶絲抗菌肽Sephadex G-25葡聚糖凝膠純度鑒定圖譜（柱子規(guī)格規(guī) 格：16mm*100cm)
【具體實施方式】
[0027] 以下通過實施形式對本發(fā)明上述說明內(nèi)容進(jìn)行進(jìn)一步的說明，一種飼用蠶絲抗菌 肽制劑及其制備方法，包括如下步驟： (1)分析天平稱取l〇〇〇g廢蠶絲，添加濃度〇. 5%的碳酸鈉溶液300mL，提取40min，即得脫 膠蠶絲，以未脫膠蠶絲作為對照試驗。
[0028] (2)將步驟（1)得到的未脫膠和已脫膠的絲素樣品放入烘箱中，以（65±1) °C的溫 度將其烘至恒重，并放入干燥器中進(jìn)行冷卻，在室溫下穩(wěn)定12 h后用電子天平分別稱質(zhì)量， 即得脫膠蠶絲和未脫膠蠶絲的干重，分別以施和此表示，計算脫膠率。
[0029] (3)利用40%的氯化鈣溶液溶