一種柑橘原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及提純方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種柑橘原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及提純方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)是世界柑橘的重要起源地之一，種質(zhì)資源豐富，類型多樣。隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高，果實(shí)品質(zhì)已經(jīng)成為果品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的核心。柑橘以其食用方便、風(fēng)味獨(dú)特及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富而倍受消費(fèi)者的青睞，然而珠心胚、性器官敗育、童期長(zhǎng)、遺傳上高度雜合等生物學(xué)特征導(dǎo)致柑橘育種工作進(jìn)展緩慢，短時(shí)間難以滿足市場(chǎng)需求的優(yōu)良品種。隨著基因工程的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)為柑橘品種遺傳改良提供了一條新途徑。
[0003]瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)指的是在短時(shí)間內(nèi)將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞內(nèi)建立起高效的表達(dá)系統(tǒng)，獲得該目標(biāo)基因短暫而高水平表達(dá)的技術(shù)。相較于穩(wěn)定基因表達(dá)技術(shù)，瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)轉(zhuǎn)染中，外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，存在于游離的載體上，并未與受體基因組染色體相整合，為基因-蛋白質(zhì)研究提供了一種快速、方便的方法，并且對(duì)穩(wěn)定遺傳進(jìn)行基因功能鑒定給與了極大的參考意義。
[0004]柑橘原生質(zhì)體首次分離由Vardiet al.(1975)完成后，鄧秀新等完善分離提純技術(shù)后，柑橘原生質(zhì)體融合及植株再生等技術(shù)日趨成熟，而原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)卻比較滯后，張倩(2009)利用電擊誘導(dǎo)柑橘不同品種原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，但轉(zhuǎn)化效率最高僅10.9%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，利用聚乙二醇熱激處理誘導(dǎo)原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，極大地提高了瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率；由于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率得到了極大的提高，因此首次成功在柑橘果實(shí)果皮和汁胞材料上，實(shí)現(xiàn)了原生質(zhì)體的分離與瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種柑橘原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟:
[0007](I)向柑橘原生質(zhì)體中添加質(zhì)粒和濃度在40-60%之間的聚乙二醇-鈣溶液，每100μ?柑橘原生質(zhì)體加入10-15yg質(zhì)粒和Ι?ομ?所述聚乙二醇-鈣溶液，混勻靜置；
[0008](2)將步驟(I)中獲得的混合物45-47°C熱激處理5-9分鐘；
[0009](3)向步驟(2)中經(jīng)熱激處理的混合物加入W5溶液，每ΙΟΟμΙ柑橘原生質(zhì)體對(duì)應(yīng)W5溶液440μ1，混勻后離心留取沉淀物；
[0010](4)向步驟(3)中獲得的沉淀物加入WI溶液，每1 O μ I柑橘原生質(zhì)體對(duì)應(yīng)WI溶液600-800μ1，培養(yǎng)24至48小時(shí)。
[0011 ]優(yōu)選地，所述柑橘原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其所述柑橘原生質(zhì)體按照如下方法獲得:
[0012]Α、將柑橘材料細(xì)碎后，加入0.7Μ甘露醇水溶液浸泡20至30分鐘；
[0013]B、用酶液置換所述甘露醇水溶液，真空滲透30分鐘后，水平搖床40rpm處理5h，搖晃混勻并濾除酶液，再加入等體積的W5溶液，水平搖床SOrpm處理30分鐘，過(guò)濾得到粗提物；
[0014]C、將步驟B中獲得的粗提物離心，沉淀即為原生質(zhì)體。
[0015]優(yōu)選地，所述柑橘原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其所述柑橘原生質(zhì)體按照如下方法精制處理:
[0016]加入W5溶液洗滌，并用預(yù)冷的MMg溶液調(diào)整原生質(zhì)體密度在2-3 X 16個(gè)/ml;
[0017]優(yōu)選地，所述柑橘原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其所述柑橘材料為幼嫩葉片、懸浮培養(yǎng)愈傷、有色層果皮或成熟汁胞粒。
[0018]優(yōu)選地，所述柑橘原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其所述酶液含纖維素酶、果膠酶、0.7M甘露醇、0.0lM 2-(N-嗎啉)乙磺酸-水合物、ImM CaCl2、以及0.1%牛血清白蛋白。
[0019]優(yōu)選地，所述柑橘原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其所述W5溶液含154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl和2mM MES，PH調(diào)至5.8。
[0020]優(yōu)選地，所述柑橘原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其所述MMg溶液含0.7M甘露醇、15mM MgCl2和24mM MES，PH調(diào)至5.8。
[0021 ]優(yōu)選地，所述柑橘原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，其所述WI溶液含0.7M甘露醇、4mM MES和4mMKCl，PH調(diào)至5.8。總體而言，通過(guò)本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明旨在利用PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，從PEG種類、PEG濃度、質(zhì)粒使用量、金屬浴熱激時(shí)間以及轉(zhuǎn)化后共培養(yǎng)時(shí)間等變量來(lái)進(jìn)行探索，大大地提高了柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率，為柑橘基因功能研究提供良好的技術(shù)平臺(tái)。
[0022]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0023]I)本發(fā)明的原生質(zhì)體分離提純方法中，酶液現(xiàn)配現(xiàn)用，采用真空滲透加速酶解，原生質(zhì)體二次釋放，極大地縮短了酶解時(shí)間，減少了酶液對(duì)原生質(zhì)體的傷害，提高了原生質(zhì)體的均一性。
[0024]2)本發(fā)明的原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法中，優(yōu)化了一系列轉(zhuǎn)化條件，明確了PEG種類為PEG4000，PEG4000濃度為40 %，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒使用量為10_15yg，轉(zhuǎn)化時(shí)47 °C金屬浴時(shí)間為5_7分鐘，以及轉(zhuǎn)化后原生質(zhì)體共培養(yǎng)時(shí)間為36-42h，大幅提高了柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率。
[0025]3)柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法可應(yīng)用于亞細(xì)胞定位、雙分子熒光互補(bǔ)等試驗(yàn)，為柑橘基因瞬時(shí)功能驗(yàn)證提供了良好的平臺(tái)，也為柑橘育種工作提供了便捷的技術(shù)。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1是實(shí)施例的紐荷爾臍橙汁胞原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化電鏡照片；
[0027]圖2是實(shí)施例2制備的原生質(zhì)體電鏡照片，其中圖2A為葉肉提取的原生質(zhì)體；圖2B為愈傷組織提取的原生質(zhì)體;圖2C為汁胞提取的原生質(zhì)體;圖2D為果皮提取的原生質(zhì)體；
[0028]圖3是實(shí)施例2葉肉提取的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化結(jié)果圖，其中圖3A為轉(zhuǎn)化后共培養(yǎng)的葉肉原生質(zhì)體明場(chǎng);圖3B為轉(zhuǎn)化后共培養(yǎng)的葉肉原生質(zhì)體熒光；
[0029]圖4是實(shí)施例3轉(zhuǎn)化質(zhì)粒使用量對(duì)柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果圖；
[0030]圖5是實(shí)施例4PEG_Ca溶液中PEG種類對(duì)柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果圖；[0031 ]圖6是實(shí)施例5PEG4000的濃度對(duì)柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果圖；
[0032]圖7是實(shí)施例6金屬浴時(shí)間對(duì)柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果圖；
[0033]圖8是實(shí)施例7共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
[0035](I)向柑橘原生質(zhì)體中添加質(zhì)粒和聚乙二醇-鈣溶液，每ΙΟΟμΙ柑橘原生質(zhì)體加入10-20yg質(zhì)粒和11ομI聚乙二醇-鈣溶液，混勻靜置。所述質(zhì)粒優(yōu)選用量15yg，柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高。
[0036]所述聚乙二醇-鈣溶液含質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%至60%的聚乙二醇、0.4M至0.6M的甘露醇和0.1M至0.3M的CaCl2。所述聚乙二醇分子量在4k至8k之間，優(yōu)選4k。所述聚乙二醇濃度優(yōu)選 40 %。
[0037]所述原生質(zhì)體按照如下步驟制備:
[0038]A、將柑橘材料細(xì)碎后，加入0.7M甘露醇水溶液浸泡20至30分鐘；
[0039]所述柑橘材料，優(yōu)選柑橘幼嫩葉片、愈傷組織、果皮或汁胞l-2g。優(yōu)選地，所述幼嫩葉片是手術(shù)刀片劃成0.5-lmm的條狀葉片、愈傷是懸浮培養(yǎng)30天左右的細(xì)碎化愈傷材料、有色層果皮是手術(shù)刀片切取成熟果子Icm X 2cm大小的有色層果皮;成熟汁胞是鑷子夾取成熟果子赤道面的汁胞粒。
[0040]B、酶解:用酶液置換所述甘露醇水溶液，真空滲透30分鐘后，水平搖床40rpm處理5h，搖晃混勻并濾除酶液;再加入等體積的W5溶液洗滌，減少酶液對(duì)原生質(zhì)體的脅迫作用，水平搖床80rpm處理30分鐘，過(guò)濾得到粗提物；
[0041 ]所述酶液含有1mM 2_(N_嗎啉)乙磺酸-水合物、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.4%纖維素酶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2 %離析酶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %牛血清白蛋白和ImM CaCl2，余量為0.7M甘露醇，pH值為5.8。所述酶解液中纖維素酶為Cellulose R_10(Yakult Honsha C0.Ltd.,Tokyo,Japan),離析酶為Macerozyme R_10(Yakult Honsha C0.Ltd.,Tokyo, Japan) 0
[0042]所述W5溶液含154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl和2mM 1^5，？!1調(diào)至5.8。
[0043]C、將步驟B中獲得的粗提物離心，沉淀即為原生質(zhì)體。
[0044]具體步驟為:采用325目細(xì)胞篩過(guò)濾酶解液，收集柑橘酶解底物，加入20mlW5溶液，水平搖床80rpm繼續(xù)處理30分鐘；收集過(guò)濾液，10g水平轉(zhuǎn)筒離心5分鐘，吸出上清液，沉淀即為原生質(zhì)體；
[0045]優(yōu)選地，所述原生質(zhì)體按照如下方法精制處理:
[0046]加入W5溶液洗滌，并用預(yù)冷的MMg溶液調(diào)整原生質(zhì)體密度在2-3 X 16個(gè)/ml;
[0047I 具體步驟如下:用10ml W5重懸步驟D中沉淀，輕柔吸打混勻后，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體密度，并計(jì)算原生質(zhì)體總數(shù)，黑暗常溫靜置l_2h; 10g水平轉(zhuǎn)筒離心3分鐘，吸出上清液，用預(yù)冷的MMg溶液重懸沉淀，并調(diào)整原生質(zhì)體密度至2-3 X 16個(gè)/ml。
[0048]所述MMg溶液含0.7M甘露醇、15mMMgCl2和24mM 1^5，？!1調(diào)至5.8。
[0049](2)將步驟(I)中或得的混合物45_47°C熱激處理6-8分鐘;具體方法如下:
[0050]將步驟(I)中獲得的混合物45-47°C金屬浴5-9分鐘，優(yōu)選47°C金屬浴7分鐘。
[0051 ] (3)向步驟(2)中經(jīng)熱激處理的混合物加入W5溶液，每ΙΟΟμΙ柑橘原生質(zhì)體對(duì)應(yīng)W5溶液440μ1，混勻后離心留取沉淀物；
[0052](4)向步驟(3)中獲得的沉淀物加入WI溶液，每1 O μ I柑橘原生質(zhì)體對(duì)應(yīng)WI溶液600-800μ1，共培養(yǎng)24至48小時(shí)，優(yōu)選36小時(shí)。
[0053]所述WI溶液含0.7Μ甘露醇、4mMMES和4mM 1((:1，？!1調(diào)至5.8。
[0054]作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述幼嫩葉片需要用手術(shù)刀片細(xì)分化