-IFNa-linker-IFN γ 〇
[0060] 5 ·重組原核表達質(zhì)粒pET32a-IFNa-l inker-IFN γ的構(gòu)建。
[0061 ] 用BamH I和Hind III限制性內(nèi)切酶分別雙酶切融合基因 IFNa-linker-IFNy和 pET32a空載體，膠回收獲得酶切后的基因片段和載體片段，應(yīng)用T4連接酶進行連接反應(yīng)，其 中，T4DNA連接酶lyL，10xT4DNA Ligase buffer lyL，酶切后的目的片段與載體以mol比為 3:1的比例加入，反應(yīng)總體積為10yL。16 °C連接4h后轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細菌，培養(yǎng)后，挑取菌 落于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，應(yīng)用菌液PCR方法篩選出陽性克隆，獲得重組 原核表達質(zhì)粒。用同樣的方法分別構(gòu)建出pET32a_IFNa和 PET32a_IFNy重組表達質(zhì)粒。 [0062]實施例2表達產(chǎn)物的鑒定、純化
[0063]將重組原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細菌，挑取陽性菌落擴大培養(yǎng)后，用IPTG誘 導(dǎo)蛋白的表達，分別用SDS-PAGE和western blot方法鑒定蛋白表達情況，western blot的 檢測結(jié)果如圖2所示，SDS-PAGE的檢測結(jié)果如圖3所示。收集各表達菌的菌體沉淀，加入PBS 震蕩混勻，超聲裂解后，分離上清液和沉淀，用含有8mol/L尿素的磷酸鹽溶液溶解沉淀，將 溶解液與Ni柱填料結(jié)合lh后過柱，收集濾液，重復(fù)過柱2次，用含有30mmol/L咪唑的磷酸鹽 溶液洗滌柱子，至洗脫液蛋白濃度為〇時停止，后用含有250mmol/L咪唑的磷酸鹽溶液洗脫 蛋白，將洗脫液放入透析袋中復(fù)性，依次用含有6，4，2，0m 〇l/L尿素濃度梯度的PBS溶液進行 透析，并用SDS-PAGE檢測蛋白純化情況。
[0064]實施例3表達產(chǎn)物抗病毒活性檢測
[0065]體外抗病毒活性檢測：在DEF上，按照動物干擾素體外抗病毒活性檢測方法，分別 檢測融合蛋白rDuIFNa-linker-rDuIFNy 抗VSV、AIV和DPV活性，以rDuIFN-α和rDuIFN- γ 為 對照組，結(jié)果顯示:融合蛋白的抗VSV、AIV和DPV活性分別為2.61 X 107U/mg、1.12 X 107U/mg 和9.07 X 106U/mg，明顯高于單個鴨干擾素的抗病毒活性;體內(nèi)抗病毒活性檢測:在北京鴨 上，分別檢測融合蛋白^)111?_-1丨111^^〇111?~丫抗六1￥和0?￥活性，并以1〇111?^〇和 rDuIFN-γ為對照組。該實驗分兩次進行，實驗1:篩選出禽流感(H5N1)抗體陰性的1日齡北 京鴨，隨機分為5組，每組10只，分別用rDuIFNa-linker-rDuIFNy蛋白、rDuIFN-a蛋白、 rDuIFN- γ蛋白和PBS進行肌肉注射，注射劑量為40ug/次/只，2日齡時進行首次注射，間隔 4h后進行第二次注射，后每天注射一次，至6日齡時停止注射。于第二次干擾素注射后2h攻 禽流感病毒。實驗過程中，每日觀察鴨采食量，精神狀態(tài)等，記錄死亡率，于攻毒后1、3、5、7、 9天采集喉和泄殖腔拭子，檢測其排毒量;實驗2:篩選出鴨瘟抗體陰性的1日齡北京鴨，隨機 分為5組，每組10只，分別用rDuIFNa-linker-rDuIFN γ蛋白、rDuIFN-a蛋白、rDuIFN- γ蛋白 和PBS進行肌肉注射，方法同實驗1，于第二次干擾素注射后2h攻鴨瘟病毒，后每日觀察鴨精 神狀態(tài)、采食量和奠便等，并記錄其死亡率。實驗1結(jié)果表明：融合蛋白rDuIFNa-l inker-rDuIFN γ對流感感染鴨的保護率可達到100 %，而單個rDuIFN-a和rDuIFN-γ的保護率分別 為90%和70%，只攻毒組存活率為40%，且融合干擾素治療組病鴨排毒量低于單個干擾素 治療組;實驗2中，融合蛋白對鴨瘟感染鴨的保護率為90 %，單個rDuIFNa和rDuIFN γ的保護 率均為70%，攻毒組存活率為30%。綜合以上結(jié)果可知，與單個rDuIFN-a和rDuIFN-γ相比， 融合蛋白rDuIFNa-linker-rDuIFNy具有更高的抗病毒活性，對病毒感染鴨可提供更好的 保護效果。
[0066]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 權(quán)利要求1所述的串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因的制備方法，其特征在于:具體包括以下步 驟： (1) 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)Genbank中提供的鴨IFN-α和IFN-γ序列，分別設(shè)計2對引物IFNa-Fl、IFNa-Rl和 IFN γ-FI、IFN γ-R1，用于擴增去除信號肽后的鴨IFN-a基因和IFN-γ基因，并分別在IFN-a 上游和IFN-γ下游加入BamH I和Hind III兩個酶切位點；同時，設(shè)計用于S0E-PCR的引物 IFNa-R2和IFN γ -F2,其中，IFNa-R2中含有部分linker序列，IFN γ -F2中含有與IFNa-R2互 補的linker序列；引物序列如下:去除信號肽后IFNa的擴增引物： IFNa-Fl的序列如SEQIDN0:4所示； IFNa-Rl的序列如SEQIDN0:5所示； IFNa-R2的序列如SEQ ID N0:6所示； 去除信號肽后IFNy的擴增引物： IFNγ-Fl的序列如SEQIDN0:7所示； IFNγ-F2的序列如SEQIDN0:8所示； IFNγ-Rl的序列如SEQIDN0:9所示； (2) 鴨α、γ干擾素基因的擴增 從鴨外周血淋巴細胞中抽提RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，得到擴增鴨α、γ干擾素基因的cDNA模 板；以此cDNA為模板，分別用上述引物IFNa-Fl、IFNa-Rl和IFNy -F1、IFN γ -R1，擴增出所需 鴨a、γ干擾素目的基因； (3) S0E-PCR擴增串聯(lián)鴨a、γ干擾素基因 該過程主要包含3個PCR反應(yīng)，第一個PCR:以IFNa-Fl和IFNa-R2為引物擴增出含有部分 1 inker序列的IFN-a，以IFN γ -F2和IFN γ -R1為引物擴增出含有部分1 inker序列的IFN- γ， 并分別進行膠回收;第二個PCR:以第一個PCR擴增出的基因為模板，不加引物，進行10-15個 PCR反應(yīng);第三個PCR反應(yīng)，以第二個PCR反應(yīng)擴增出的基因為模板，用引物IFNa-Fl和IFN γ-R1擴增出融合基因串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因。3. -種表達串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因的原核表達質(zhì)粒PET32a-IFNa-linker-IFNy，其特 征在于:通過BamH I和Hind III酶切位點將權(quán)利要求1所述的串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因連接 到原核表達質(zhì)粒pET32a( + )上。4. 權(quán)利要求3所述的原核表達質(zhì)粒pET32a-IFNa-linker-IFNy的制備方法，其特征在 于:具體步驟如下： 1) 鴨串聯(lián)鴨a、γ干擾素基因克隆至PMD-19T載體： 將權(quán)利要求1所述的鴨串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因連接入pMD-19T載體，16°C連接過夜后進 行轉(zhuǎn)化;挑取菌落接種于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，用菌液PCR的方法篩選出 陽性克隆，測序正確后擴大培養(yǎng)，獲取該基因的陽性質(zhì)?？?0-191'-正_-1丨111?^-正1^; 2) 重組原核表達質(zhì)粒pET32a-IFNa-linker-IFNy的構(gòu)建： 用BamH I和Hind III限制性內(nèi)切酶分別對pMD-19T-IFNa-linker-IFNy和pET32a空載 體進行雙酶切，膠回收獲得酶切后的基因片段和載體片段，應(yīng)用T4連接酶，將目的片段連接 至丨JpET32a( + )載體上，構(gòu)建出重組原核表達質(zhì)粒pET32a-IFNα-linker-IFNγ;將上述構(gòu)建好 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌，培養(yǎng)后，挑取菌落接種于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中進行 培養(yǎng)，應(yīng)用菌液PCR方法篩選出陽性克隆，獲得重組原核表達質(zhì)粒pET32a-IFNa-linker-IFN ?。5.權(quán)利要求1所述的串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因的應(yīng)用，其特征在于:權(quán)利要求1所述的串 聯(lián)鴨α、γ干擾素基因表達的融合蛋白在制備鴨的抗病毒藥物方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的基因融合表達。本發(fā)明所述的串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。本發(fā)明還提供了串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因的制備方法，以及表達串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因的原核表達質(zhì)粒pET32a-IFNα-linker-IFNγ及其制備方法，以及串聯(lián)鴨α、γ干擾素基因表達的融合蛋白在制備鴨的抗病毒藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明成功構(gòu)建了重組鴨α、γ干擾素原核表達質(zhì)粒pET32a-IFNα-linker-IFNγ，實現(xiàn)了鴨IFN-α和IFN-γ基因在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)上的串聯(lián)表達，還可以保證兩個干擾素基因以1:1的比例進行表達。
【IPC分類】C12N15/70, C12N15/62, C12N15/10
【公開號】CN105647945
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】任濤, 高佩, 黎玉蓮
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月9日