增5'端側(cè)翼序列的過(guò)程如圖3所示。在核心序列內(nèi)部設(shè)計(jì)3個(gè)引物： Sp5-1、Sp5-2、Sp5-3,這三個(gè)引物的距離依次接近5'端。首先使用引物Sp5-1與簡(jiǎn)并引物 LAD1進(jìn)行一次預(yù)擴(kuò)增（Pre-amplification)，接下來(lái)以預(yù)擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，用引物Sp5-2 和AC1進(jìn)行一次擴(kuò)增（Primary)，最后用Sp5-3和AC1引物，以一次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物為模板進(jìn) 行二次擴(kuò)增（Secondary)。3'端擴(kuò)增采用相同的步驟。核心序列內(nèi)進(jìn)行Tail-PCR設(shè)計(jì)擴(kuò) 增木聚糖酶基因上游和下游引物如表2所示。
[0052] 表2側(cè)翼序列所用到的引物
[0053] Table 2. Primers for Flanking secqence
[0054]
[0055] 注：R = A/G，S = C/G，W = A/T，B = C/G/T，N = A/C/G/T
[0056] 預(yù)擴(kuò)增使用Sp3_l，LAD1，以預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物為模板，使用引物Sp3_2和AC1進(jìn)行 一次擴(kuò)增，電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)一次擴(kuò)增已經(jīng)能獲得特異性較高的條帶（圖4)。圖中可以看 到泳道2和泳道4分別出現(xiàn)了 lOOObp和2000bp大小的兩條亮帶，切膠回收，連T克隆載體 測(cè)序。得到3'端側(cè)翼序列xynA-3'。
[0057] Sp5-l、Sp5-2特異性引物分別于與LADUAC1引物配對(duì)，Sp3-2、Sp5-3特異性引物 分別于與LADUAC1引物配對(duì)，進(jìn)行HiTail-PCR，通過(guò)兩輪反應(yīng)即獲得了特異性較好的條帶 (圖5)。圖中泳道1，3分別出現(xiàn)了大小約為1200bp左右的亮帶，切膠回收，連T克隆載體 測(cè)序，得到5'端側(cè)翼序列xynA-5'。
[0058] 回收電泳中亮度高的條帶，連接T載體，通用引物M13測(cè)序，分別得到3'端、5'端 的側(cè)翼序列，因?yàn)樘禺愋砸锸窃诤诵男蛄袃?nèi)部設(shè)計(jì)得到，這樣側(cè)翼序列會(huì)和核心序列有 一段是重疊的，用DNAMAN軟件分析找到這些重疊序列，進(jìn)而將三段基因拼接到一起，最終 得到一段長(zhǎng)為1383bp基因全長(zhǎng)序列SEQ-1。
[0059] 實(shí)施例2 :重組木聚糖酶Xyn A蛋白分析
[0060] 2. lpET28a(+)表達(dá)載體的構(gòu)建：
[0061] 2. 1. 1PCR 擴(kuò)增基因 xynA
[0062] 根據(jù)xynA設(shè)計(jì)引物，綜合考慮表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)（MCS)和xynA序列，在xynA 兩端引入酶切位點(diǎn)EcoR I和Xho I。PCR反應(yīng)體系參考表2. 1。PCR循環(huán)條件為：94°C， 4min ;94°C，30s ;68°C，30s ;72°C，90s ;共 30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 10min。PCR產(chǎn)物切膠回 收。引物由北京奧科鼎盛公司合成，引物見(jiàn)表3。
[0063] 表3克隆xynA的引物
[0064] Table 3 Primers for xynA
[0065]
[0066] 2· 1· 2 重組質(zhì)粒 pET28a_xyn4 的構(gòu)建
[0067] 將表達(dá)載體pET28a和帶有酶切位點(diǎn)的xynA用EcoR I和Xho I分別進(jìn)行雙酶切， 37°C溫浴4h。切膠回收xynA和切開(kāi)的表達(dá)載體。T4DNA連接酶連接xynA和線性pET28a (+)， 摩爾比3 : 1，16°C中連接12h，獲得大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET28a-xynA。按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指 南第三版》中所述方法熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株"轉(zhuǎn)化得到的陽(yáng)性克隆用于培養(yǎng)及木聚 糖酶表達(dá)。
[0068] 2. 2重組Xyn A酶分析
[0069] 2. 2. 1同源性比對(duì)
[0070] 在NCBI上對(duì)xynA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，共找到51條與xynA同源性在70%以上 的序列（圖6)，相比較同源性較高的是來(lái)自菌株Streptomyces megasporus(HM003041. 1)， Streptomyces halstedii (U41627. 1), Streptomyces chattanoogensis (AF121864. 2)木聚 糖酶的基因，同源性分別達(dá)到81%，81%和74%，而且和木聚糖酶的同源性最高，說(shuō)明該基 因也是木聚糖酶，另一方面說(shuō)明該基因比較新穎，具有較高的研究?jī)r(jià)值。
[0071] 2. 2. 2信號(hào)肽預(yù)測(cè)
[0072] 將xynA翻譯成為氨基酸序列，通過(guò)在線信號(hào)肽預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http ://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP)對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖7,信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)結(jié)果表明該酶是一個(gè) 具有信號(hào)肽的分泌蛋白。
[0073] 2. 2. 3氨基酸保守功能區(qū)分析
[0074] 蛋白質(zhì)保守功能區(qū)分析采用蛋白質(zhì)保守序列（⑶D)數(shù)據(jù)庫(kù)（http ://www. ncbi. nlm. nih. Gov/structure/cdd/cdd. shtml.)來(lái)預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖8,表明該酶具有典型的第10 族糖苷水解酶保守區(qū)域的典型結(jié)構(gòu)。
[0075] 此外，該基因還編碼一段大小為10kDa的纖維素結(jié)合域（CBD)。去掉CBD區(qū)域，木 聚糖酶分子量大小為34kDa。
[0076] 對(duì)木聚糖基因全長(zhǎng)xynA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，xynA全長(zhǎng)共有1393堿基對(duì)，G， C含量占68 %。DNAMAN軟件分析，該基因能編碼460個(gè)氨基酸如SEQ-2,預(yù)測(cè)分子量約為 48. 2kDa，等電點(diǎn)pi為9. 04。且含有一段信號(hào)肽序列為SEQ-3。去掉該信號(hào)肽序列，剩余氨 基酸分子量約為43. 6kDa，等電點(diǎn)pi = 8. 19,與天然菌株產(chǎn)的一個(gè)約44kDa的木聚糖酶大 小相同。分析蛋白質(zhì)保守序列，結(jié)果表明該酶具有F/10糖苷水解酶的典型結(jié)構(gòu)，并能翻譯 一段大小為10kDa的纖維素結(jié)合域，肽序列為SEQ-4。去掉CBD區(qū)域，木聚糖酶分子量大小 為 34kDa。
[0077] 2. 2. 4木聚糖酶活性分析
[0078] 粗粗酶液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、CMSFF柱層析進(jìn)行純化，得到了電泳純分子量為 44kDa的木聚糖酶，該過(guò)程中蛋白質(zhì)、總酶活力、比活力、純化倍數(shù)及回收率的變化見(jiàn)表 4. 3,經(jīng)過(guò)40%~80%的硫酸銨沉淀，木聚糖酶純化了 2. 6倍，回收到總酶活的82. 9%。經(jīng) 過(guò)層析柱CMSFF后純化了 3. 79倍，回收到5. 3%的酶活。
[0079] 各步的純度電泳圖及酶譜圖見(jiàn)圖9。經(jīng)過(guò)兩步純化在分子量為44kDa的地方得到 電泳純的蛋白。酶譜分析顯示，此條帶具有木聚糖酶活性。
[0080] 大腸桿菌重組子誘導(dǎo)產(chǎn)酶后經(jīng)過(guò)超聲破壁，使得木聚糖酶溶解到上清中采用DNS 法測(cè)定木聚糖酶活力。具體操作如下：用0. 05M，pH值為5. 3的檸檬酸緩沖液稀釋上清液 樣品，取100pl樣品加入至900pll%的樺木木聚糖底物中，于55°C反應(yīng)smin，加入lml的 DNS反應(yīng)終止液，于沸水中顯色15min，加入1ml40%的酒石酸鉀鈉溶液，于540nm下測(cè)定吸 光度，計(jì)算得到木聚糖酶酶活。DNS法測(cè)的該酶活力為19. 7±1. 2U/mL。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種木聚糖酶的核苷酸序列，其序列細(xì)節(jié)為SEQ-1。2. 這個(gè)序列的至少90 %的同源。3. -種木聚糖酶的多肽，其序列細(xì)節(jié)為SEQ-2。4. 這個(gè)序列的至少90 %的同源。5. -種木聚糖酶的信號(hào)肽，其序列細(xì)節(jié)為SEQ-3。6. 這個(gè)序列的至少90 %的同源。7. -種木聚糖酶的纖維素結(jié)合域（CBD)，其序列細(xì)節(jié)為SEQ-4。8. 這個(gè)序列的至少90 %的同源。9. 包含權(quán)利1，2, 3,4, 5,6, 7,8的重組載體。10. 權(quán)利9的大腸桿菌的重組表達(dá)系統(tǒng)。11. 類似于權(quán)利10在乳酸桿菌，釀酒酵母，芽孢桿菌（如枯草芽孢桿菌），曲霉（如黑 曲霉或者米曲霉）中的表達(dá)應(yīng)用。12. 權(quán)利1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11在造紙工業(yè)，食品加工，紡織工業(yè)，飼料工業(yè)，生物 能源，化妝品，醫(yī)藥保健品，以及各種生物反應(yīng)器的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種來(lái)源于教酒鏈霉菌(Streptomyces？chartreusis？L1105)的木聚糖酶Xyn？A的基因，包括其核酸和蛋白質(zhì)/多肽序列。該基因編碼的木聚糖酶全長(zhǎng)共有1393個(gè)堿基對(duì)，G，C含量占68％，編碼460個(gè)氨基酸，分子量約為48.2kDa，等電點(diǎn)pI為9.04。含有一段信號(hào)肽序列。該酶具有F/10糖苷水解酶的典型結(jié)構(gòu)，能翻譯一段大小為10kDa的纖維素結(jié)合域(CBD)。DNS法測(cè)得該酶活為19.7±1.2U/mL。作為一種堿性的木聚糖酶，該酶及其作用產(chǎn)物具備在造紙工業(yè)，紡織工業(yè)，食品加工，生物能源，飼料工業(yè)，化妝品，醫(yī)藥，保健品，釀酒，農(nóng)作物生產(chǎn)，以及各類生物反應(yīng)器中的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12N15/63, C12N9/42, C12N15/56, C12N1/21, C12N1/19, C12N1/15, C12R1/52
【公開(kāi)號(hào)】CN105647944
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】李秀婷, 熊科, 朱運(yùn)平, 滕超, 閆子祥
【申請(qǐng)人】李秀婷, 熊科, 朱運(yùn)平
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2014年12月11日