玉米ZmGFT1基因在提高植物葉酸含量中的應用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學領域，具體地說，涉及玉米ZmGFTI基因在提高 植物葉酸含量中的應用。
【背景技術】
[0002] 葉酸屬于水溶性的B族維生素，是四氫葉酸及其衍生物的統(tǒng)稱。由于氧化狀態(tài)不同 而存在不同形式的葉酸衍生物，如四氫葉酸、5-甲基四氫葉酸、5-甲酰四氫葉酸、5，10-亞甲 基四氫葉酸等。在大多數物種中，葉酸在一碳轉移反應中作為供體或受體發(fā)揮重要作用。葉 酸參與嘌呤、甲酰甲硫氨酸-tRNA、胸苷酸、甘氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸的生物合成，并且葉 酸還參與泛酸鹽的合成、甲基化反應和組氨酸代謝。在植物中，葉酸還與木質素、生物堿、甜 菜素和葉綠素的生物合成相關，對植物的光呼吸也是必須的。人類和其他動物不能自身合 成葉酸，只能從飲食中攝取所需的葉酸，植物是人類獲取葉酸的主要來源。葉酸參與這些重 要的生命過程，因此葉酸攝入不足會許多造成嚴重的健康問題，例如巨幼紅細胞貧血、神經 管缺陷等，還有導致癌癥的潛在風險。所以葉酸缺乏成為一個全球性的健康問題。盡管在有 些國家和地區(qū)實行了食物強化和維生素片補充等有效的措施來改善葉酸缺乏的狀況，但是 對于不發(fā)達國家和地區(qū)來說還是很難實現的。
[0003] 5-甲酰四氫葉酸，又稱做亞葉酸，是最穩(wěn)定的自然形式的葉酸，作為一種穩(wěn)定的儲 存形式是玉米籽粒中最豐富的葉酸組分。其通過絲氨酸羥甲基轉移酶的副反應生成，可以 抑制絲氨酸羥甲基轉移酶和其它大部分葉酸依賴酶的活性。5-甲酰四氫葉酸是唯一一個不 參與一碳代謝的葉酸形式，其在代謝活躍組織中發(fā)揮的具體作用目前還不清楚。葉酸遇光、 遇熱就不穩(wěn)定，容易降解失去活性，所以人體真正能從食物中獲得的葉酸并不多。提高葉酸 中穩(wěn)定形式葉酸所占的比例，增加葉酸的生物可利用率，也是葉酸強化的一種重要途徑。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供玉米ZmGFTI基因在提高植物葉酸含量中的應用。
[0005] 為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明通過對玉米自然變異群體513份自交系材料中5-甲 酰四氫葉酸含量進行測定，結合RNA-Seq數據中挖掘到的基因型數據，并且評估自然變異群 體群體結構和親緣關系的影響，利用全基因組關聯分析的方法定位到一個位于玉米第5號 染色體上顯著影響5-甲酰四氫葉酸含量的基因 GFT1，其編碼谷氨酸亞胺甲基轉移酶1。該基 因所在位點的編號為GRMZM2G124863(參考玉米基因組B72RefGen_v2)。
[0006] 玉米自交系Qi319中GRMZM2G124863基因的CDS全長為993bp，核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，GRMZM2G124863基因編碼330個氨基酸，序列如SEQ ID NO: 2所示。經過NCBI比對， 該蛋白的21-228位氨基酸為亞胺甲基轉移酶環(huán)化脫氨酶結構域的N端亞結構域。與玉米中 的其他兩個GFT基因 GRMZM2G349536和GRMZM2G083711編碼蛋白的序列同源性較低，分別為 40.0%和 39.8%。
[0007] 而在玉米自交系B73中，多態(tài)性位點Chr5.s_19676906(S2069)和Chr5.s_19676907
[A/G]的等位變異，共同造成該蛋白底物結合活性位置的氨基酸變異（由天冬酰胺變?yōu)楦拾?酸），從而影響5-甲酰四氫葉酸的含量。玉米自交系B73ZmGFTl基因的⑶S全長為981bp，核苷 酸序列如SEQIDN0 :9所示，ZmGFTl基因編碼326個氨基酸，序列如SEQIDN0:10所示。
[0008]本發(fā)明提供玉米ZmGFTl基因在提高植物葉酸含量中的應用。
[0009] 所述玉米ZmGFTl基因的⑶S序列如下：
[0010] i)SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或
[0011] ii)SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且 表達相同功能蛋白質的核昔酸序列;或
[0012] iii)在嚴格條件下與SEQ ID NO: 1所示序列雜交且表達相同功能蛋白質的核苷酸 序列，所述嚴格條件為在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下雜交，并用該溶液洗膜;或
[0013] iv)與i)、ii)或m)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達相同功能蛋白質的 核苷酸序列。
[0014] 本發(fā)明還提供攜帶有玉米ZmGFTl基因的載體、宿主細胞、轉基因細胞系及工程菌。 [0015]攜帶有玉米ZmGFTl基因的表達載體可通過使用Ti質粒、植物病毒載體、直接DNA轉 化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術方法導入植物細胞中（Weissbach，1998,Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463頁；Geiserson和 Corey,1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition)〇
[0016] 前述的應用，采用農桿菌介導的方法，將攜帶有玉米ZmGFTl基因的表達載體轉入 植物組織中，篩選轉基因植株。所述表達載體包括植物雙元表達載體，優(yōu)選PCAMBIA3301、 pH2GW7〇
[0017] 本發(fā)明所述植物包括但不限于玉米、擬南芥。
[0018]本發(fā)明又對另一個自然變異群體的155份玉米材料的GFT1基因進行重測序，挖掘 出更多的等位變異，利用候選基因關聯分析的方法，發(fā)現了 7個顯著影響5-甲酰四氫葉酸含 量的多態(tài)性位點。7個多態(tài)性位點中，4個插入缺失位點位于5'非翻譯區(qū)，3個SNPs位于基因 編碼區(qū)。其中位于該基因編碼區(qū)的多態(tài)性位點Chr5.s_19676906(S2069)和Chr5. s_ 19676907 [A/G]等位變異，共同造成了該蛋白底物結合活性位置的氨基酸變異（由天冬酰胺 變?yōu)楦拾彼幔?，顯著影響了 5-甲酰四氫葉酸含量，可以解釋5-甲酰四氫葉酸變異的28%。
[0019] 本發(fā)明還提供與玉米葉酸含量相關的SNP標記，所述SNP標記位于玉米自交系B73 第5號染色體Chr5. s_19676906和Chr5. s_19676907位點（即玉米自交系B73ZmGFTl基因如 SEQ ID NO:9所示序列的第682位和第683位堿基），兩個位點處的堿基均為G的玉米葉酸含 量顯著高于兩個位點處的堿基均為A的玉米葉酸含量。
[0020] 上述SNP標記位于玉米自交系Qi319ZmGFTl基因如SEQ ID N0:1所示序列的第694 位和第695位堿基，兩個堿基均為G的玉米葉酸含量顯著高于兩個堿基均為A的玉米葉酸含 量。
[0021] 本發(fā)明還提供用于檢測所述與玉米葉酸含量相關的SNP標記的引物，包括正向引 物F 5 ' -ATGGAGCCTCATCACGCAAAC-3 ' 和反向引物R 5 ' -TCAGTCGTCAGCGCAAGC-3 '。
[0022] 本發(fā)明還提供含有所述引物F和R的用于檢測玉米葉酸含量的試劑盒。
[0023]本發(fā)明還提供利用所述與玉米葉酸含量相關的SNP標記或所述引物或所述試劑盒 鑒定玉米葉酸含量的方法。
[0024]所述方法包括以下步驟：
[0025] 1)提取待測玉米的基因組DNA;
[0026] 2)以待測玉米的基因組DNA為模板，利用所述引物F和R，進行PCR擴增反應；
[0027] 3)檢測PCR擴增產物。擴增產物第694位和第695位堿基，兩個堿基均為G的玉米葉 酸含量顯著高于兩個堿基均為A的玉米葉酸含量。
[0028]本發(fā)明進一步提供與玉米葉酸含量相關的SNP標記在玉米分子標記輔助育種中的 應用。
[0029]本發(fā)明利用全基因組關聯分析的方法，首次在玉米中發(fā)現了 5-甲酰四氫葉酸代謝 的關鍵基因 ZmGFTl，并且發(fā)現了該基因中顯著影響5-甲酰四氫葉酸含量的關鍵SNP位點。這 不僅為在玉米和其他作物中研究葉酸代謝提供了理論基礎，還可以通過基因工程手段，提 高轉基因植物的葉酸含量，緩解人類在葉酸營養(yǎng)方面的隱形饑餓問題。
【附圖說明】
[0030]圖1為本發(fā)明實施例1中玉米ZmGFTl基因的PCR擴增結果;A為來源于玉米自交系 B73和Qi319的ZmGFTl基因擴增，用于轉化擬南芥來研究自然變異對于5-甲酰四氫葉酸含量 的影響;B為來源于自交系Qi319的ZmGFTl基因的擴增用于轉化玉米來研究ZmGFTl的功能。 [0031]圖2為本發(fā)明實施例2中ZmGFTl基因在玉米中的相對表達量;從左到右依次為根、 莖、莖尖、嫩葉、花絲、果穗和授粉后10、15、20、25天的胚^!11)和胚乳化11)。
[0032]圖3為本發(fā)明實施例3中對轉ZmGFTl基因植株材料的PCR鑒定結果;A分別為轉化了 自交系B73和Qi319ZmGFTl基因的轉基因擬南芥植株，其中B1、B2、B6、B7、B18、B32SR B73GFT1CDS陽性擬南芥轉基因植株，〇1、〇2、〇3、〇4為轉如3196?11003陽性擬南芥轉基因植 株;B為轉化了 Qi319ZmGFTl的轉基因玉米材料，其中26、128、147、177、347、372為陽性轉基 因玉米植株。
[0033]圖4為本發(fā)明實施例3中RT-PCR檢測轉基因擬南芥和轉基因玉米中ZmGFTl的表達 量;A為陽性轉基因擬南芥ZmGFTl轉錄水平檢測，81、8236、87、818、832代表擬南芥轉入來 自于自交系B73的ZmGFTl，Ql、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6代表擬南芥轉入來自于自交系Qi319的 ZmGFTl ;B中13-128、13-147、13-177、13-372為陽性轉基因玉米中ZmGFTl轉錄水平檢測結 果。
[0034]圖5為本發(fā)明實施例3中轉基因擬南芥種子和轉基因玉米葉片中5-甲酰四氫葉酸 含量的檢測結果;A中灰色柱子代表轉入來自于B73的ZmGFTl轉基因擬南芥種子中葉酸水 平，黑色柱子代表轉入來自于Qi319的轉基因擬南芥種子中葉酸水平，白色柱子代表col野 生型擬南芥種子中的葉酸水平。B中白