一種利用表面微結(jié)構(gòu)激活星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，特別提供了一種利用表面微結(jié)構(gòu)激活星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中體積最大、數(shù)量最多、分布最廣的一種膠質(zhì)細(xì)胞，具有大量的放射狀突起。星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)發(fā)育、突觸形成、血腦屏障構(gòu)建、能量代謝等多個方面發(fā)揮決定性作用，對維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)與神經(jīng)元的正常功能至關(guān)重要。
[0003]星形膠質(zhì)細(xì)胞存在靜息態(tài)和激活態(tài)兩種狀態(tài)。當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到各種有害因素，如低氧、外傷、炎癥等損傷刺激后，星形膠質(zhì)細(xì)胞從靜息態(tài)轉(zhuǎn)化為激活態(tài)，成為活化星形膠質(zhì)細(xì)胞。活化膠質(zhì)細(xì)胞的作用為“雙刃劍”。一方面，活化的膠質(zhì)細(xì)胞迅速迀移并包圍損傷區(qū)域，避免損傷范圍的進(jìn)一步擴(kuò)大；此外，還可分泌多種營養(yǎng)因子保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，例如，NGF、BDNFn GDNF、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)等。另一方面，活化膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生形成的膠質(zhì)瘢痕對于神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生起嚴(yán)重阻礙作用。當(dāng)再生的神經(jīng)軸突遇到膠質(zhì)瘢痕時，會形成一種萎縮的末端小球狀結(jié)構(gòu)，后者不能再伸展形成生長錐，從而使再生的神經(jīng)軸突停滯在膠質(zhì)瘢痕處，影響神經(jīng)軸突的生長。
[0004]目前既有的激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法如機(jī)械損傷、低氧、炎癥因子刺激等，均無法避免激活帶來的反應(yīng)性膠質(zhì)瘢痕的形成。因此，開發(fā)一種激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞后即可發(fā)揮其促神經(jīng)再生的作用又限制其反應(yīng)性增生的新技術(shù)，具有重大的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種簡便的通過凸凹不平的表面微結(jié)構(gòu)激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，該方法獲得的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞既可發(fā)揮其促神經(jīng)再生的作用又能限制膠質(zhì)瘢痕的形成。
[0006]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案得以實現(xiàn)的:
[0007]—種利用培養(yǎng)物表面微結(jié)構(gòu)激活星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，具體步驟如下
[0008](I)采用濕法刻蝕等微加工方法，獲得帶有凸凹不平的微米級表面微結(jié)構(gòu)的模板，用PDMS澆筑后固化，將其揭下后獲得帶有凸凹不平微結(jié)構(gòu)的PDMS細(xì)胞培養(yǎng)表面；
[0009](2)采用原代培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為激活對象，待細(xì)胞生長至細(xì)胞融合，將細(xì)胞用
0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，
[0010](3)將細(xì)胞懸液添加至微結(jié)構(gòu)表面，細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)1-14天；
[0011](4)從上述方法獲得的星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)鑒定表現(xiàn)為細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化、細(xì)胞干性增強(qiáng)、葡萄糖轉(zhuǎn)運增強(qiáng)等一系列激活表現(xiàn)。
[0012]所獲得的凸凹不平微結(jié)構(gòu)PDMS表面特征如下:表面帶有陣列式形狀規(guī)則的微凹陷或微凸起，其形狀可為圓形、方形、五邊形、六邊形、橢圓、三角形、直線、曲線或這些形狀的組合體。
[0013]所述微凹陷與其周邊隆起之間的高度差為5?100 μ m，邊緣隆起的寬度為O?50 μ mD
[0014]所述所述的陣列式形狀規(guī)則的微凹陷，其形狀的邊長為5?100 μm0
[0015]所述帶有表面微結(jié)構(gòu)的模板材質(zhì)為娃板、玻璃或SU-8 ；
[0016]所述帶有微結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)表面，其材質(zhì)可以為PDMS、PMMA、聚苯乙烯、PLGA、殼聚糖或其他多種高分子材料。
[0017]所述獲得的星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在14天內(nèi)具有EMT轉(zhuǎn)化、細(xì)胞干性增強(qiáng)、葡萄糖轉(zhuǎn)運增強(qiáng)等一系列激活表現(xiàn)。
[0018]所產(chǎn)生的活化星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞用于神經(jīng)系統(tǒng)外傷及缺血缺氧性腦病的治療。
[0019]所產(chǎn)生的活化星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞用于帕金森及阿爾茨海默病的治療。
[0020]采用濕法刻蝕等微加工方法，獲得帶有凸凹不平的微米級表面微結(jié)構(gòu)的模板，將Sylgard 184單體和引發(fā)劑Silicone Ela Stomer按體積比10:1混合均勾，饒筑于模板上，800C 30分鐘后PDMS固化。用鑷子將PDMS揭下，將帶有微結(jié)構(gòu)的一面朝上放入培養(yǎng)皿中，利用PDMS本身的黏性將其固定于培養(yǎng)皿底部。紫外照射過夜滅菌。
[0021]從上述方法獲得的星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)鑒定表現(xiàn)為細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化、細(xì)胞干性增強(qiáng)、葡萄糖轉(zhuǎn)運增強(qiáng)等一系列激活表現(xiàn)。EMT轉(zhuǎn)化具體表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)波形蛋白表達(dá)增加，b-連環(huán)蛋白向細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)位。細(xì)胞干性增強(qiáng)表現(xiàn)為S0X-2及0CT-4表達(dá)增加。葡萄糖轉(zhuǎn)運增強(qiáng)表現(xiàn)為葡糖糖轉(zhuǎn)移酶GLUT-1表達(dá)增加。
[0022]本發(fā)明提供的利用表面微結(jié)構(gòu)激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞包括原代提取的哺乳類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，也包括永生化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系。
[0023]本發(fā)明的優(yōu)點是可以利用培養(yǎng)物表面物理微結(jié)構(gòu)激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，且可以避免形成膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生導(dǎo)致的膠質(zhì)瘢痕。本發(fā)明在神經(jīng)系統(tǒng)損傷性及退行性疾病的治療中具有廣闊應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0024]圖1帶有正六邊形凹陷陣列微結(jié)構(gòu)的PDMS芯片電鏡圖
[0025]圖2邊長30 μπι正六邊形凹表面微結(jié)構(gòu)促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞波形蛋白表達(dá)以及b-連環(huán)蛋白核轉(zhuǎn)位；其中IPDMS平表面培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的b-連環(huán)蛋白主要位于細(xì)胞膜上，在細(xì)胞周邊呈連續(xù)性表達(dá)；2邊長30 μ m正六邊形凹表面培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的b-連環(huán)蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中。
[0026]圖3與PDMS平表面相比，邊長30 μ m正六邊形凹表面微結(jié)構(gòu)可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞S0X-2 及 0CT-4 表達(dá)；
[0027]圖4與PDMS平表面相比，邊長30 μ m正六邊形凹表面微結(jié)構(gòu)可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞GLUT-1 表達(dá)；
[0028]圖5與PDMS平表面相比，邊長30 μ m正六邊形凸表面微結(jié)構(gòu)可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞波形蛋白及S0X-2表達(dá)；
【具體實施方式】
[0029]下面的實施例將對本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。
[0030]實施例1
[0031]利用計算機(jī)輔助設(shè)計和濕法刻蝕方法，制作邊長為30 μπι的正六邊形凸表面膜板，正六邊形之間距離為5 μπι，凸表面與凹槽之間的高度差為60 μπι。將PDMS單體和引發(fā)劑按10:1的比例混合均勻，澆筑于模板上進(jìn)行反膜，80°C 30分鐘后PDMS固化。用鑷子將PDMS揭下，獲得帶有凹表面正六邊形微結(jié)構(gòu)的PDMS芯片(見圖1)。將帶有微結(jié)構(gòu)的一面朝上放入培養(yǎng)皿中，利用PDMS本身的黏性將其固定于培養(yǎng)皿底部。紫外照射過夜滅菌。
[0032]原代提取新生24h乳鼠大腦皮層星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，去除雜細(xì)胞后待細(xì)胞生長至融合，將細(xì)胞用0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液添加至PDMS微結(jié)構(gòu)表面，置入培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)1-14天。對凹表面上生長的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化、細(xì)胞干性增強(qiáng)、葡萄糖轉(zhuǎn)運增強(qiáng)等一系列激活表現(xiàn)。細(xì)胞內(nèi)波形蛋白表達(dá)增加，b-連環(huán)蛋白向細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)位(見圖2)，干性相關(guān)蛋白S0X-2及0CT-4表達(dá)增加(見圖3)，葡糖糖轉(zhuǎn)移酶GLUT-1表達(dá)增加(見圖4)。
[0033]實施例2
[0034]制作邊長為30 μ m的正六邊形凹表面膜板，正六邊形之間距離為5 μ m，凹表面與周圍凸起的邊框之間的高度差為60 μπι。用PDMS反膜后獲得帶有凸表面正六邊形微結(jié)構(gòu)的PDMS芯片。將帶有微結(jié)構(gòu)的一面朝上放入培養(yǎng)皿中，利用PDMS本身的黏性將其固定于培養(yǎng)皿底部。紫外照射過夜滅菌。
[0035]將原代提取的乳鼠星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞懸液添加至PDMS微結(jié)構(gòu)表面，置入培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)1-14天。對凸表面上生長的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示細(xì)胞發(fā)生了與凹表面相似的變化，細(xì)胞內(nèi)波形蛋白及干性相關(guān)蛋白S0X-2表達(dá)均增加(圖5)。
【主權(quán)項】
1.一種利用表面微結(jié)構(gòu)激活星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于該方法的具體步驟如下: (1)采用濕法刻蝕等微加工方法，獲得帶有凸凹不平的微米級表面微結(jié)構(gòu)的模板，用PDMS澆筑后固化，將其揭下后獲得帶有凸凹不平微結(jié)構(gòu)的PDMS細(xì)胞培養(yǎng)表面； (2)采用原代培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為激活對象，待細(xì)胞生長至細(xì)胞融合，將細(xì)胞用0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液； (3)將細(xì)胞懸液添加至微結(jié)構(gòu)表面，細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)1-14天； (4)從上述方法獲得的星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)鑒定表現(xiàn)為細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化、細(xì)胞干性增強(qiáng)、葡萄糖轉(zhuǎn)運增強(qiáng)等一系列激活表現(xiàn)。2.按照權(quán)利要求1所述的利用表面微結(jié)構(gòu)激活星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于所獲得的帶有凸凹不平微結(jié)構(gòu)的PDMS表面特征如下:表面帶有陣列式形狀規(guī)則的微凹陷或者微凸起，其形狀可為圓形、方形、五邊形、六邊形、橢圓、三角形、直線、曲線或這些形狀的組合體。3.按照權(quán)利要求2所述的利用表面微結(jié)構(gòu)激活星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于所述微凹陷與其周邊隆起之間的高度差為5?100 μm，邊緣隆起的寬度為O?50 μm。4.按照權(quán)利要求2所述的利用表面微結(jié)構(gòu)激活星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于所述所述的陣列式形狀規(guī)則的微凹陷，其形狀的邊長為5?100 μπι。5.按照權(quán)利要求1所述的利用表面微結(jié)構(gòu)激活星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于所述帶有表面微結(jié)構(gòu)的模板材質(zhì)為硅板、玻璃或SU-8 ;所述帶有微結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)表面，其材質(zhì)可以為PDMS、ΡΜΜΑ、聚苯乙烯、PLGA、殼聚糖或其他多種高分子材料。6.按照權(quán)利要求1所述的利用表面微結(jié)構(gòu)激活星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于其中所述獲得的星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在14天內(nèi)具有EMT轉(zhuǎn)化、細(xì)胞干性增強(qiáng)、葡萄糖轉(zhuǎn)運增強(qiáng)等一系列激活表現(xiàn)。7.按照權(quán)利要求1所述的利用表面微結(jié)構(gòu)激活星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于所產(chǎn)生的活化星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞用于神經(jīng)系統(tǒng)外傷及缺血缺氧性腦病的治療。8.按照權(quán)利要求1所述的利用表面微結(jié)構(gòu)激活星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于所產(chǎn)生的活化星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞用于帕金森及阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的治療。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用表面微結(jié)構(gòu)激活星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，屬細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體步驟為：(1)獲得帶有凸凹不平微結(jié)構(gòu)的PDMS細(xì)胞培養(yǎng)表面；(2)采用原代培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為激活對象，待細(xì)胞生長至細(xì)胞融合，將細(xì)胞用0.25％胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，(3)將細(xì)胞懸液添加至微結(jié)構(gòu)表面，細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)1-14天；(4)從上述方法獲得的星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)鑒定表現(xiàn)為細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化、細(xì)胞干性增強(qiáng)、葡萄糖轉(zhuǎn)運增強(qiáng)等一系列激活表現(xiàn)。本發(fā)明的優(yōu)點是可以利用培養(yǎng)物表面物理微結(jié)構(gòu)激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，且可以避免形成膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生導(dǎo)致的膠質(zhì)瘢痕。本發(fā)明在神經(jīng)系統(tǒng)損傷性及退行性疾病的治療中具有廣闊應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61K35/30, A61P25/00, A61P9/10, C12N5/079, A61P25/28, A61P25/16
【公開號】CN105647868
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】秦建華, 張敏, 張旭, 許慧
【申請人】中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年12月4日