一株解淀粉芽孢桿菌的篩選及其在刺參養(yǎng)殖上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及功能微生物篩選及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌的篩 選及其在刺參養(yǎng)殖上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著國內(nèi)外刺參需求量的增加及水產(chǎn)品貿(mào)易的國際化發(fā)展，近年來，刺參養(yǎng)殖業(yè) 發(fā)展突飛猛進(jìn)。但是，高密度養(yǎng)殖及不規(guī)范操作所導(dǎo)致的養(yǎng)殖環(huán)境惡化、疾病的發(fā)生給刺參 養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)防治疾病的方法主要是使用抗生素，抗生素使用易產(chǎn) 生耐藥性菌株問題，且存在動物體內(nèi)殘留問題，危害食品安全，因此尋找抗生素替代品成為 必然。
[0003] 益生菌作為外源的添加劑可以參與動物體內(nèi)的微生物平衡，直接通過增強(qiáng)動物對 腸內(nèi)有害微生物群落的抑制作用，或通過增強(qiáng)非特異性免疫功能來預(yù)防疾病，進(jìn)而間接起 到促進(jìn)動物生長的作用，提高動物飼料的轉(zhuǎn)化率。因此，近些年對于益生菌的篩選尤其是養(yǎng) 殖動物土著菌的篩選成為本領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點，也對水產(chǎn)飼料配方的改進(jìn)具有重要的意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株新型解淀粉芽孢桿菌及其在刺參養(yǎng)殖上的應(yīng)用。所述解 淀粉芽孢桿菌篩選自健康刺參腸道，該菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶能力，能夠提高 刺參腸道中淀粉酶活力，促進(jìn)刺參的生長，提高刺參的免疫力和抗病力，可廣泛應(yīng)用于刺參 的養(yǎng)殖及水產(chǎn)飼料領(lǐng)域。
[0005] 本發(fā)明一方面提供了一株解淀粉芽孢桿菌，于2015年12月24日保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心;請求 保藏人:魯東大學(xué);保藏編號為CCTCC N0:M2015774,該菌命名為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens ZYTC1-1〇
[0006] 本發(fā)明另一方面提供了上述解淀粉芽孢桿菌在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用。具體為：當(dāng)刺 參苗變態(tài)為稚參后，攝食能力進(jìn)一步加強(qiáng)，每斤刺參在2000-4000頭時，在鼠尾藻粉中以 10 9CFU/g的添加量投喂上述解淀粉芽孢桿菌，連續(xù)投喂一個月。
[0007] 本發(fā)明篩選到的解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1，具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶的能力， 促進(jìn)刺參生長，降低刺參病害發(fā)生的幾率。所述解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1可作為益生菌應(yīng)用 于刺參的養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，有效提高刺參腸道中淀粉酶活力，對刺參的生長具有顯著的促 進(jìn)作用，還可以有效提高刺參的免疫力及對燦爛弧菌的抵抗能力。與對照組相比，添加1〇 9 CFU/g解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1的益生菌組中刺參的終末平均體重、特定生長率、淀粉酶活 性、吞噬活性、超氧化物歧化酶活性、總抗氧化力活性和一氧化氮合酶活性分別提高了 17 · 72%、17 · 77%、81 · 34%、41 · 99%、8 · 47%、61 · 70% 及 54 · 21%，而累積死亡率下降了 25%;取得了 顯著的技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0008] 圖1:本發(fā)明一株解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1的菌落形態(tài)。
[0009] 解淀粉芽孢桿菌ZYTC1 -1，已于2015年12月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 其簡稱為CCTCC，其保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015774。
【具體實施方式】
[0010]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人 員了解本發(fā)明。
[0011] 實施例1 菌株的分離、篩選、鑒定及安全性驗證 1、樣品 采集于煙臺市萊州刺參養(yǎng)殖場的健康刺參的腸道。
[0012] 2、培養(yǎng)基： 1)芽孢桿菌分離培養(yǎng)基:葡萄糖l〇g，磷酸鈣5g，硫酸銨0.5g，氯化鉀0.2g，七水硫酸鎂 〇. lg，硫酸錳〇.〇〇〇lg，硫酸亞鐵〇.〇〇〇lg，酵母提取物〇. 5g，蒸餾水1000ml，pH6.8-7.2，瓊脂 20g，121 °C滅菌 30min。
[0013] 2)改良的TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB)30g，氯化鈉10g，蒸餾水 1000ml，pH7 · 4-7 · 6，配制固體培養(yǎng)基加入15-20g的瓊脂，12Γ C滅菌20min。
[0014] 3)淀粉水解培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，可溶性淀粉2g，蒸餾水 1000ml，ρΗ7·2-7·4,配制固體培養(yǎng)基加入15-20g的瓊脂，115 °C滅菌20min。
[0015] 4)酪素水解雙層平板培養(yǎng)基：（1)溶液A:蛋白胨10g、酵母膏3g、瓊脂10g、陳海水 1000ml; (2)溶液B:酪蛋白10g、蒸餾水250ml; (3)溶液C:瓊脂10g、蒸餾水250ml。在堿性 條件下溶解酪蛋白，配制溶液B時，滴加 NaOH溶液使酪蛋白剛好全部溶解。分別將三種溶液 滅菌（121°C，20min)，待其都冷卻到50 °C左右，先將B液和C液混合，倒入平板形成一薄層， 待薄層凝固后將A液倒入，制成雙層平板。
[0016] 3、篩選方法 健康刺參從養(yǎng)殖場采集后，加冰運(yùn)輸至實驗室，無菌條件下解剖獲得刺參腸道，腸道稱 重后，加入9倍體積的無菌生理鹽水，用勻漿器在冰上進(jìn)行研磨，充分研磨后進(jìn)行10倍梯度 稀釋，接種芽孢桿菌分離培養(yǎng)基，28 ° C培養(yǎng)24h-48h。選取均勻清晰的單菌落，在改良的TSB 培養(yǎng)基上劃線純化。純化后的細(xì)菌，用改良的TSB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用甘油生理鹽水-80 °C 保存。單菌落依次命名為 ZYTC1-1、ZYTC1-2、ZYTC1_3、……、ZYTC1_9。
[0017] 將單菌落過夜培養(yǎng)16-18h，分別點種于淀粉水解培養(yǎng)基和酪素水解雙層平板培養(yǎng) 基上，每種菌點種3個重復(fù)，28°C恒溫培養(yǎng)，48 h形成明顯菌落后觀察透明圈的大小;淀粉水 解培養(yǎng)基需滴加盧戈氏碘液。具體結(jié)果如表1所示。
[0018] 表1潛在益生菌株產(chǎn)酶能力
注：1表示不產(chǎn)生蛋白酶或者淀粉酶，1-2表示產(chǎn)酶能力一般，>2表示產(chǎn)酶能力較強(qiáng)。
[0019] 從表1的數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明篩選到的9株芽孢桿菌中菌株ZYTC1 -1產(chǎn)蛋白酶和 淀粉酶的能力最強(qiáng)。
[0020] 4、菌株鑒定 1)菌落形態(tài)特征:將上述菌株ZYTC1-1重新劃線培養(yǎng)，其單菌落呈現(xiàn)為扁平狀、圓形、土 黃色、邊緣鋸齒狀，革蘭氏染色陽性。
[0021] 2)提取上述菌株ZYTC1-1的基因組DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增16S rDNA序列，通過測序 獲得ZYTC1-1的16S rDNA序列，具體序列見附件序列表的核苷酸序列，將該菌株的16S rDNA 序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列號GenBank NO· KU588858。通過BLAST比對分析，其與 已公布的多株解淀粉芽孢桿菌的16S rDNA序列相似度高達(dá)99%，鑒定證實菌株ZYTC1-1為解 淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，與生化鑒定結(jié)果一致。
[0022] 3)將上述菌株ZYTC1-1命名為解淀粉芽孢桿菌ZYTCl-l(Bacillus amyloliquefaciens ZYTC1-1)，已于2015年12月24日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典 型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO:M 2015774。
[0023] 5、安全性驗證 益生菌的篩選應(yīng)以安全性為出發(fā)點，因此安全性檢驗是益生菌篩選中必不可少的環(huán) 節(jié)，小規(guī)模的浸浴實驗是判斷潛在益生菌對養(yǎng)殖動物幼體安全性的常用方法。使用平均體 重為〇. 2g的刺參，