7、往蜜蜂巢脾多糖提取液C中加入占其體積3-5倍的無(wú)水乙醇，在0-26Γ下醇 析4-24h后，進(jìn)行4000r-10000r/min的離心操作10-30min，棄上清液并鼓風(fēng)干燥揮發(fā)干乙 醇，得到蜜蜂巢脾多糖提取物。
[0042] 本發(fā)明提供的一種蜜蜂巢脾多糖提取物的制備方法實(shí)施方式，能夠從蜜蜂巢脾中 提取多糖提取物，能夠增加蜜蜂巢脾的利用價(jià)值，且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本較低。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 本實(shí)施例一種蜜蜂巢脾多糖提取物的制備方法，包括步驟：
[0045] 步驟 1、將西方蜜蜂Apis mellifera L. (Apis mellifera Linnaeus)的三年以上 的巢脾，_20°C冷凍4h以上，粉碎后過(guò)50目篩，巢脾粉使用乙醚回流除蠟，除蠟后鼓風(fēng)烘干， 揮發(fā)乙醚，得到巢脾干燥粉末。
[0046] 本實(shí)施中，西方蜜蜂(Apis mellifera Linnaeus)，為蜜蜂屬中型體中等的一種， 產(chǎn)于西方，簡(jiǎn)稱西蜂。主要的西方蜜蜂亞種有：意大利蜜蜂(A.m. ligustica)、卡尼鄂拉蜂 (八.111.031'11；^3)、高加索蜜蜂(厶.111.0311038；^3)、歐洲黑蜂(厶.111.1116111€6^)、突尼斯蜜蜂 (A.m. intermissa)、東非蜜蜂(A.m. scutelata)和安納托利亞蜜蜂(A.m.anatolica)等。 [0047]步驟2、在巢脾干燥粉末中加入巢脾干燥粉末質(zhì)量10倍以上的蒸餾水后，加入木瓜 蛋白酶進(jìn)行酶解得到酶解液;其中，木瓜蛋白酶添加量為每l〇〇g巢脾干燥粉末添加7.2萬(wàn)U， 酶解溫度為40 °C，酶解時(shí)間0.5h;
[0048] 步驟3、將所述酶解液通過(guò)120目紗布過(guò)濾，取上清液；
[0049] 步驟4、在進(jìn)行步驟3操作后所得的濾渣中，再加入10倍以上的蒸餾水后，加入7.2 萬(wàn)U/100g巢脾干燥粉末的木瓜蛋白酶重復(fù)上述酶解及過(guò)濾操作1次;將取得的上清液合并， 到蜜蜂巢脾多糖提取液A;
[0050] 步驟5、將所述蜜蜂巢脾多糖提取液A利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在80°C下進(jìn)行濃縮lh，離心 后棄去沉淀得到蜜蜂巢脾多糖提取液B;
[0051] 步驟6、往蜜蜂巢脾多糖提取液B中加入占其體積1/4的由氯仿和正丁醇配制成的 混合液，充分抽提20min后，進(jìn)行4000r/min的離心操作10min，取上清液;其中，在制成的所 述混合液中，氯仿和正丁醇的體積比為4:1;對(duì)獲取的所述上清液再重復(fù)本步驟的操作3次， 獲得去蛋白蜜蜂巢脾多糖提取液C;
[0052]步驟7、往蜜蜂巢脾多糖提取液C中加入占其體積3倍的無(wú)水乙醇，在室溫下醇析 24h后，進(jìn)行4000r/min的離心操作5min，棄上清液并鼓風(fēng)干燥揮發(fā)干乙醇，得到蜜蜂巢脾多 糖提取物。
[0053]本實(shí)施例制備的蜜蜂巢脾多糖提取物為淺褐色粉末，易吸濕，易溶于水，得率為 10.26%，多糖質(zhì)量含量為33.14%。
[0054] 實(shí)施例2
[0055]本實(shí)施例一種蜜蜂巢脾多糖提取物的制備方法，包括步驟：
[0056]步驟1、將意大利蜜蜂的三年以上的巢脾，-20°C冷凍4h以上，粉碎后過(guò)100目篩，巢 脾粉使用乙醚回流除蠟，除蠟后鼓風(fēng)烘干，揮發(fā)乙醚，得到巢脾干燥粉末。
[0057]步驟2、在巢脾干燥粉末中加入巢脾干燥粉末質(zhì)量15倍以上的蒸餾水后，加入食品 級(jí)的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解得到酶解液;其中，木瓜蛋白酶添加量為每l〇〇g巢脾干燥粉末添 加9.6萬(wàn)U，酶解溫度為50 °C，酶解時(shí)間1.5h;
[0058] 步驟3、將所述酶解液通過(guò)120目紗布過(guò)濾，取上清液；
[0059] 步驟4、在進(jìn)行步驟3操作后所得的濾渣中，再加入15倍以上的蒸餾水后，加入9.6 萬(wàn)U/100g巢脾干燥粉末的木瓜蛋白酶重復(fù)上述酶解及過(guò)濾操作2次;將取得的上清液合并， 到蜜蜂巢脾多糖提取液A;
[0060] 步驟5、將所述蜜蜂巢脾多糖提取液A在90°C下進(jìn)行濃縮2h，離心后棄去沉淀得到 蜜蜂巢脾多糖提取液B;
[0061] 步驟6、往蜜蜂巢脾多糖提取液B中加入占其體積1/4的由氯仿和正丁醇配制成的 混合液，充分抽提20min后，進(jìn)行8000r/min的離心操作10min，取上清液;其中，在制成的所 述混合液中，氯仿和正丁醇的體積比為4:1;對(duì)獲取的所述上清液再重復(fù)本步驟的操作3次， 獲得去蛋白蜜蜂巢脾多糖提取液C;
[0062] 步驟7、往蜜蜂巢脾多糖提取液C中加入占其體積4倍的無(wú)水乙醇，在4°C下醇析12h 后，進(jìn)行8000r/min的離心操作20min，棄上清液并鼓風(fēng)干燥揮發(fā)干乙醇，得到蜜蜂巢脾多糖 提取物。
[0063] 本實(shí)施例制備的蜜蜂巢脾多糖提取物為淺褐色粉末，易吸濕，易溶于水，得率為 21.46%，多糖質(zhì)量含量為78.02%。
[0064] 實(shí)施例3
[0065] 本實(shí)施例一種蜜蜂巢脾多糖提取物的制備方法，包括步驟：
[0066]步驟1、將意大利蜜蜂的三年以上的巢脾，-20°C冷凍4h以上，粉碎后過(guò)120目篩，巢 脾粉使用乙醚回流除蠟，除蠟后使用80%v/v乙醇進(jìn)行脫脂脫單糖處理;進(jìn)行脫脂脫單糖處 理后，鼓風(fēng)烘干，得到巢脾干燥粉末；
[0067]步驟2、在巢脾干燥粉末中加入巢脾干燥粉末質(zhì)量20倍以上的蒸餾水后，加入木瓜 蛋白酶進(jìn)行酶解得到酶解液;其中，木瓜蛋白酶添加量為每l〇〇g巢脾干燥粉末添加12萬(wàn)U， 酶解溫度為60°C，酶解時(shí)間lh;
[0068] 步驟3、將所述酶解液通過(guò)120目紗布過(guò)濾，取上清液；
[0069]步驟4、在進(jìn)行步驟3操作后所得的濾渣中，再加入20倍以上的蒸餾水后，加入12萬(wàn) u/100g巢脾干燥粉末的木瓜蛋白酶，重復(fù)上述酶解及過(guò)濾操作1次;將取得的上清液合并， 到蜜蜂巢脾多糖提取液A;
[0070] 步驟5、將所述蜜蜂巢脾多糖提取液A在100°C下進(jìn)行濃縮3h，離心后棄去沉淀得到 蜜蜂巢脾多糖提取液B;
[0071] 步驟6、往蜜蜂巢脾多糖提取液B中加入占其體積1/4的由氯仿和正丁醇配制成的 混合液，充分抽提20min后，進(jìn)行10000r/min的離心操作lOmin，取上清液;其中，在制成的所 述混合液中，氯仿和正丁醇的體積比為4:1;對(duì)獲取的所述上清液再重復(fù)本步驟的操作3次， 獲得去蛋白蜜蜂巢脾多糖提取液C;
[0072]步驟7、往蜜蜂巢脾多糖提取液C中加入占其體積5倍的無(wú)水乙醇，在0°C下醇析4h 后，進(jìn)行l(wèi)〇〇〇〇r/min的離心操作10min，棄上清液并鼓風(fēng)干燥揮發(fā)干乙醇，得到蜜蜂巢脾多 糖提取物。
[0073] 本實(shí)施例制備的蜜蜂巢脾多糖提取物為淺褐色粉末，易吸濕，易溶于水，得率為 13.57%，多糖質(zhì)量含量為64.01 %。
[0074] 本發(fā)明實(shí)施例還提供一種蜜蜂巢脾多糖提取物，所述蜜蜂巢脾多糖提取物中包括 多糖，且多糖的含量大于50 %。
[0075]進(jìn)一步地，所述蜜蜂巢脾多糖提取物中，總多糖含量為20-80%。
[0076] 本發(fā)明實(shí)施例提供的一種蜜蜂巢脾多糖提取物，可采用前述任一實(shí)施例所述的蜜 蜂巢脾多糖提取物的制備方法獲得。
[0077] 本發(fā)明實(shí)施例提供的一種蜜蜂巢脾多糖提取物，能夠從蜜蜂巢脾中提取，從而能 夠增加蜜蜂巢脾的利用價(jià)值，且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本較低。
[0078] 下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。
[0079] 1、木瓜蛋白酶提取蜜蜂巢脾多糖的單因素實(shí)驗(yàn)如下：
[0080]精確稱取一定量的粉料，在其他條件都相同的情況下，分別考慮水浴時(shí)間（0.5h、 111、1.511、211、2.511)、水浴溫度（30°(：、40°(：、50°(：、60°(：)和酶添加量(2.4、4.8、7.2、9.6、12萬(wàn) U/100g)這三個(gè)單因素對(duì)蜜蜂巢脾多糖提取率的影響。
[0081] 1.1溫度對(duì)蜜蜂巢脾多糖提取的影響
[0082] 固定7.2萬(wàn)U/100g木瓜蛋白酶添加量，酶解2h，于30 °C，40 °C，50 °C，60 °C水浴酶解， 研究溫度對(duì)提取蜜蜂巢脾多糖的影響。
[0083]在酶催化反應(yīng)中，溫度是重要參數(shù)之一。圖2為酶解溫度對(duì)提取蜜蜂巢脾多糖的影 響曲線圖。
[0084]由圖2可以看出，隨著酶解溫度的升高，蜜蜂巢脾多糖得率亦隨之增加，在60°C時(shí) 提取率最高，幾乎是30°C的四倍。當(dāng)溫度超過(guò)60°C后，酶就會(huì)失活，因此采用60°C熱水浸提 是最佳的選擇。
[0085] 1.2水浴時(shí)間對(duì)蜜蜂巢脾多糖提取的影響
[0086] 固定7.2萬(wàn)U/g木瓜蛋白酶添加量，酶解溫度50 °C，酶解0.5h，lh，1.5h，2h，2.5h，研 究酶解時(shí)間