血管緊張素i氨基酸片段的衍生物、血管緊張素i抗原及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及血管緊張素 I氨基酸片段的衍生物、血管緊張素 I抗原及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管緊張素(Angiotensin)是一種能夠使收縮血管，并由此造成壓升高血的多肽。 血管緊張素是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的一部分，許多降血壓藥物以血管緊張素為靶 分子。血管緊張素也能夠刺激腎上腺分泌。
[0003] 血管緊張素 I(Angiotensin I，AI)是由腎素作用于血管緊張素原轉(zhuǎn)變而來，因此 可反映"血漿腎素活性"（簡(jiǎn)稱PRA)。原發(fā)性高血壓、特發(fā)性或假性醛固酮增多癥、腎上腺癌、 腎上腺皮質(zhì)增多癥激素合成缺陷等疾病會(huì)導(dǎo)致血管緊張素 I降低;而繼發(fā)性醛固酮增多癥、 腎功能減退、腎炎、充血性心力衰竭、腎血管瘤、分泌腎素的腎球旁器增生癥、嗜鉻細(xì)胞瘤、 肝硬化等疾病會(huì)導(dǎo)致血管緊張素 I升高。因此，AI濃度的測(cè)定已成為原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓 等疾病診斷與研究的重要指標(biāo)。
[0004] AI的測(cè)定中，抗體是決定分析靈敏度和特異性的主要因素之一。由于AI分子量較 小，因此必須偶聯(lián)在大分子上以后才能用于免疫原刺激產(chǎn)生抗體。申請(qǐng)?zhí)枮?200910250475.5的中國(guó)專利公開了一種血管緊張素 I免疫原的制備方法，采用戊二醛為交 聯(lián)劑將AI連接在蛋白載體上，但是該方法會(huì)造成抗原和載體的無序交聯(lián)，容易改變AI的天 然抗原決定簇，以及引起載體自身交聯(lián)沉淀，因此并不是一種優(yōu)選的免疫原制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有特定序列 的AI氨基酸片段的衍生物，將這些AI氨基酸片段的衍生物與活化載體反應(yīng)可以制得完全的 AI抗原，以該抗原接種健康動(dòng)物可以成功獲得AI抗體，由此可實(shí)現(xiàn)AI的高效檢測(cè)。
[0006] 為此，本發(fā)明第一方面提供了一種血管緊張素 I(AI)氨基酸片段的衍生物，其序列 選自：
[0007] a)Cys-R-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0008] b)Cys-R-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0009] c)Cys-R-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0010] d)Cys-R-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0011] e)Cys-R-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0012] f)Cys-R-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0013] g)Cys-R-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0014] h)Cys-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0015] i)Cys-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0016] j)Cys-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0017] k)Cys-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0018] 1)Cys-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0019] m)Cys-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0020] n)Cys-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0021] 其中R選自氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸和氨基己酸。
[0022]本發(fā)明第二方面提供一種血管緊張素 I抗原，其含有如本發(fā)明第一方面所述的血 管緊張素 I氨基酸片段的衍生物的序列之一。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，所述抗原由如本發(fā)明第一方面所述的血管緊張素 I氨基酸片段的衍 生物與活化載體反應(yīng)制得。
[0024] 在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實(shí)施例中，所述載體選自血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、陽(yáng)離子 牛血清白蛋白、牛γ -球蛋白、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白、破傷風(fēng)類毒素、多聚賴氨酸和葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶。
[0025]本發(fā)明第三方面提供了一種如本發(fā)明第二方面所述的血管緊張素 I抗原的制備方 法，其包括：
[0026]步驟S1，將含有交聯(lián)劑和載體的混合液進(jìn)行反應(yīng)制得活化載體懸液；
[0027]步驟S2,將活化載體懸液進(jìn)行分離純化處理制得純化的活化載體溶液；
[0028]步驟S3,將純化的活化載體溶液與血管緊張素 I氨基酸片段的衍生物溶液混合后 反應(yīng)制得血管緊張素 I抗原懸液；
[0029]步驟S4,將血管緊張素 I抗原懸液進(jìn)行分離純化處理制得純化的血管緊張素 I抗原 溶液。
[0030] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，在步驟S1中，在含有交聯(lián)劑和載體的混合液中，交聯(lián)劑 與載體的摩爾比為（10-2000) :1。
[0031] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，在步驟S3中，所述載體與血管緊張素 I氨基酸片段的 衍生物的摩爾比為（10-2000) :1。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明方法，所述血管緊張素 I氨基酸片段的衍生物溶液是由血管緊張素 I氨 基酸片段的衍生物溶于C溶劑制得，并且所述血管緊張素 I氨基酸片段的衍生物溶液的濃度 為0. l-50mg/ml。優(yōu)選所述血管緊張素 I氨基酸片段的衍生物溶液的濃度為0 . l-4mg/ml。所 述C溶劑選自純化水、PBS緩沖液、二甲亞砜、二甲基甲酰胺或其組合。
[0033] 本發(fā)明中，所述交聯(lián)劑包括磺基琥珀酰亞胺基-4_(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1- 羧酸酯（sulf〇-SMCC)、m-苯甲酰馬來酰亞胺-N-羥基磺基琥珀酰亞胺（sulf〇-MBS)、E-馬來 酰亞胺己酸磺基琥珀酰亞胺酯（sulfo-EMCS)和N-(4-馬來酰亞胺氧化丁酰)-琥珀酰亞胺磺 酸鈉鹽(sulfo-GMBS)中的一種或幾種。
[0034] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，在步驟S1中，所述含有交聯(lián)劑和載體的混合液由交聯(lián) 劑溶于載體溶液形成。
[0035] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，在步驟S1中，所述含有交聯(lián)劑和載體的混合液由交 聯(lián)劑溶液與載體溶液混合形成。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明方法，所述交聯(lián)劑溶液由交聯(lián)劑溶于B溶劑形成，并且所述交聯(lián)劑溶液 的濃度為1 -1 〇〇mg/ml;優(yōu)選所述交聯(lián)劑溶液的濃度為1 -1 Omg/ml;所述B溶劑選自純化水、 PBS緩沖液和二甲亞砜。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明方法，所述載體溶液由載體溶于A溶劑形成，并且所述載體溶液的濃度 為l-100mg/ml;優(yōu)選所述載體溶液的濃度為l-10mg/ml;所述A溶劑為純化水或PBS緩沖液。
[0038] 本發(fā)明第四方面提供了一種如本發(fā)明第二方面所述的抗原或者如本發(fā)明第三方 面所述的方法制備的抗原在制備抗血管緊張素 I抗體中的應(yīng)用。
[0039]本發(fā)明第五方面提供了一種抗血管緊張素 I抗體，其由如本發(fā)明第二方面所述的 抗原或者如本發(fā)明第三方面所述的方法制備的抗原對(duì)健康動(dòng)物進(jìn)行免疫接種后產(chǎn)生。
[0040]本發(fā)明第六方面提供了一種如本發(fā)明第五方面所述抗體的制備方法，其包括：
[0041 ]步驟L，采用抗血管緊張素 I抗原對(duì)健康動(dòng)物進(jìn)行免疫接種；
[0042]步驟Μ，采取免疫血清并測(cè)定免疫血清的抗體效價(jià)，并在抗體效價(jià)低于預(yù)定值時(shí)重 復(fù)步驟L-M;
[0043]步驟Ν，當(dāng)抗體效價(jià)2預(yù)定值時(shí)收集抗體血清，并進(jìn)行分離純化處理，制得抗血管 緊張素 I抗體；
[0044] 其中，所述預(yù)定值為1:5000。
[0045]本發(fā)明第七方面提供了一種如本發(fā)明第五方面所述的抗血管緊張素 I抗體或如本 發(fā)明第六方面所述的方法制備的抗血管緊張素 I抗體在制備用于血管緊張素 I免疫分析的 試劑中的應(yīng)用。
[0046] 本發(fā)明第八方面提供了一種如本發(fā)明第五方面所述的抗血管緊張素 I抗體或如本 發(fā)明第六方面所述的方法制備的抗血管緊張素 I抗體在制備用于血管緊張素 I化學(xué)發(fā)光免 疫測(cè)定的試劑盒中的應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅 起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0048] 如前所述，由于血管緊張素是小分子多肽，激發(fā)不了動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，也無法直 接應(yīng)用于免疫檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)ΑΙ的高效檢測(cè)，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)ΑΙ抗原及其抗體的制備和 檢測(cè)進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)了一些具有特定序列的ΑΙ氨基酸片段的衍生物，并且進(jìn)一步研 究發(fā)現(xiàn)，將這些ΑΙ氨基酸片段的衍生物與活化載體反應(yīng)可以制得完全的ΑΙ抗原，以該抗原 接種健康動(dòng)物可以成功獲得ΑΙ抗體，由此可以實(shí)現(xiàn)ΑΙ的高靈敏檢測(cè)。本發(fā)明正是基于上述 發(fā)現(xiàn)作出的。
[0049] 因此，本發(fā)明第一方面所提供的ΑΙ氨基酸片段的衍生物，由本發(fā)明的發(fā)明人研究 發(fā)現(xiàn)，并用固相多肽合成儀制得，其序列選自：
[0050] a)Cys-R-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0051 ] b)Cys-R-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0052] c)Cys-R-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0053] d)Cy s-R_Tyr_11e -Hi s _Pr〇-Phe -Hi s -Leu;
[0054] e)Cys-R-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0055] f)Cys-R-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0056] g)Cys-R-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0057] h)Cys-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0058] i)Cys-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0059] j)Cys-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0060] k)Cys-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0061 ] 1)Cys-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0062] m)Cys-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0063] n)Cys-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0064] 其中序列a)_g)中的R選自氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸和氨基己酸。 [0065] 尤其優(yōu)選的是，AI氨基酸片段的衍生物的 Pro-Phe-His-Leu; c)Cys-R-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His_Leu;或者d)Cys-R-Tyr_Ile-His-Pro-Phe-His-Leu 其中1?優(yōu)選氨基丁酸。
[0066] 本發(fā)明第二方面所提供的AI抗原由本發(fā)明第一方面所述的AI氨基酸片段的衍生 物與活化載體反應(yīng)制得，因此，也可以理解為本發(fā)明的AI抗原含有本發(fā)明第一方面所述的 AI氨基酸片段的衍生物。
[0067] 本發(fā)明對(duì)所用載體沒有特別的限制，例如可以采用常規(guī)的載體。在本發(fā)明的一些 實(shí)施例中，所述載體，例如可以選自血藍(lán)蛋白（KLH)、牛血清白蛋白（BSA)、陽(yáng)離子牛血清白 蛋白（