灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)涉及一種動(dòng)物軟骨活性肽，具體涉及一種灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]灰星鯊(Mustelus griseus)俗名沙條，又稱灰貂鯊，為軟骨魚綱真鯊目皺唇鯊科星鯊屬的一種。分布于西北太平洋區(qū)，包括中國南海、東海、黃海、臺(tái)灣等海域，以及韓國釜山和木浦和日本南部等海區(qū)。
[0003]灰星鯊膽和肝、肉、皮、魚鰭等均能入藥?；倚酋徠ぞ哂薪怍~蝦毒和消食化積等功效?；倚酋徣饩哂薪∑⒁鏆?，祛瘀消腫，滋補(bǔ)強(qiáng)壯等功效，能夠治療體虛，傷口愈合緩慢，脾虛浮腫等疾病?；倚酋彸峋哂凶萄a(bǔ)強(qiáng)壯，益氣，補(bǔ)虛等功效?；倚酋徠ぞ哂邢e，解諸魚毒等功效。灰星鯊膽具有清熱解毒，消腫，活血等功效?；倚酋徆蔷哂徐铒L(fēng)除濕，健脾止瀉，活血止痛等功效。灰星鯊心具有健脾益胃，消痰化飲，益氣開膈等功效。能夠治療因脾胃虛弱引起的內(nèi)停痰飲，飲食不化，胸腕脹滿，嘔吐泄瀉等癥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用的灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽:該灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽為八肽化合物，氨基酸序列為Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)，ESI_MS測定分子量為905.00 Da0
[0006]該灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法為:
I)灰星鯊軟骨總蛋白粗提物的制備:稱取灰星鯊軟骨切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機(jī)中勻漿至糊狀，將糊狀的灰星鯊軟骨浸于4?6倍體積的1.0 mol/L鹽酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7?8)，于4 °C下攪拌抽提36?48 h。提取液在4 °C下以4000?6000 r/min離心15?25 min，棄殘?jiān)占锨逡?上清液繼續(xù)在4°C、10000?12000 r/min離心15?25 1^11，取上清液用0.22 μπι微孔濾膜過濾除去不溶性雜質(zhì)。將濾液裝入分子截留量為8 000的透析袋中，用Tris-HCKpH 7.6)緩沖液于4 °C下透析24?48 h，透析袋內(nèi)溶液即為灰星鯊軟骨總蛋白粗提物。
[0007]2)灰星鯊軟骨丙酮分級(jí)沉淀蛋白的制備:取灰星鯊軟骨總蛋白粗提物在冰浴下緩慢加入預(yù)冷丙酮至丙酮濃度為30%，在-20 °C下靜置4?6 h后，于4 °C、10000?12000 r/min高速離心20 min，取上清液，加入預(yù)冷丙酮至溶液最終丙酮濃度為60%，獲得灰星鯊軟骨60%丙酮沉淀蛋白，凍干，即為60%丙酮分級(jí)沉淀蛋白。
[0008]3)灰星鯊軟骨丙酮分級(jí)沉淀蛋白的酶解:取灰星鯊軟骨60%丙酮分級(jí)沉淀蛋白按照料液比Ig: 3?5 mL溶于Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH 7.5?8.5)，按照60%丙酮分級(jí)沉淀蛋白重量的2.0?3.0%加入胰蛋白酶(1.9\1041]/^)，于40 °C酶解3?5 h，然后于90 °C、10 min滅酶活，酶解液于4 °C、10000?12000 r/min離心15?25 min，棄殘?jiān)占锨逡海?br>得軟骨蛋白酶解液。
[0009]4)灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，凍干，得超濾酶解物;將超濾酶解物次經(jīng)離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得抗氧化肽。
[0010]作為優(yōu)選，所述的步驟I)中的灰星藍(lán)為灰星藍(lán)(Mustelus griseus)。
[0011]作為優(yōu)選，所述步驟4)的離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
離子交換樹脂層析:將上述超濾酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經(jīng)過DEAE-52離子交換樹脂層析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強(qiáng)組分凍干，即為離子交換層析酶解物；
凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex G_15柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強(qiáng)組分凍干，即為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80?100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除活性得I個(gè)高活性抗氧化肽Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)，ESI_MS測定分子量為905.00 Da0
[0012]再優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量10?15 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX
4.6mm,5 μπι)；流動(dòng)相:水-乙腈梯度洗脫(O?32min乙腈濃度由O勻速升至50%);洗脫速度0.6~1.0 mL/min;紫外檢測波長280 nm。
[0013]本發(fā)明還提供灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的用途:由于其具有安全無毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，因而可以作為藥品、保健食品和食品的添加劑。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時(shí)，Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用；Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)具有安全無毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品和食品的添加劑。
【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明的DEAE-52離子交換樹脂層析圖。
[0016]圖2是本發(fā)明的葡聚糖凝膠SephadexG_15層析圖。
[0017]圖3葡聚糖凝膠SephadexG-15制備酶解物的RP-HPLC^H
[0018]圖4Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)的質(zhì)譜圖。
[0019]圖5Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)的抗脂質(zhì)氧化能力。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
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