赤魟軟骨蛋白抗氧化肽及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種動(dòng)物軟骨蛋白抗氧化肽，具體涉及一種赤魟軟骨蛋白抗氧化肽及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]赤魟(Dasyatis akajei)，屬軟骨魚(yú)綱，下孔總目，鲼形目，魟科，魟屬。赤魟為常見(jiàn)軟骨魚(yú)類(lèi)，分布于我國(guó)沿海，也見(jiàn)于西江，直至廣西南寧、龍州、桂平，以及日本、朝鮮半島。
[0003]赤魟為我國(guó)常用海洋藥物，本草中習(xí)稱海鷂魚(yú)，始載于《本草拾遺》。赤魟全身是寶，其肉、牙齒、尾刺等均可入藥。赤魟肉具有滋陰補(bǔ)血，益腎通淋。主治小便不利，澀痛，男子白池霄淋，小兒府積。赤缸牙齒具有殺蟲(chóng)，截癥，解毒等功效，能夠治療捧虐，痛捧癥等疾病。赤魟肝具有養(yǎng)肝明目，滋補(bǔ)強(qiáng)壯，壯骨等功效。赤魟尾刺有毒，具有清熱解毒，止痛，軟堅(jiān)散結(jié)等功效。赤魟魚(yú)油有小毒，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯，活血降脂等功效。而現(xiàn)代藥理也證明赤魟具有多種顯著的藥理活性，赤魟軟骨黏多糖具有良好的抗凝血活性及降血脂作用，與現(xiàn)用抗凝血藥物活性相當(dāng)；赤魟尾刺20 %乙醇提取物可以抑制小鼠S180肉瘤的生長(zhǎng)，赤魟軟骨提取的多肽可以顯著減少肝癌H22的毛細(xì)血管的數(shù)目和雞胚絨毛尿囊膜新生血管的數(shù)目。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀提供一種能夠清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用的赤魟軟骨蛋白抗氧化肽。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為:一種赤魟軟骨蛋白抗氧化肽:該赤魟軟骨蛋白抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽為四肽化合物，氨基酸序列為I Ie-Glu-Pro-His (^?!0 451-]\^測(cè)定分子量為494.55 Da。
[0006]該赤魟軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法為:
I)赤魟軟骨總蛋白粗提物的制備:稱取孔鰩軟骨切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機(jī)中勻漿至糊狀，將糊狀的赤魟軟骨浸于4?6倍體積的1.0 mol/L鹽酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7?8)，于4 °C下攪拌抽提36?48 h。提取液在4 °C下以4000?6000 r/min離心15?25 min，棄殘?jiān)占锨逡?；上清液繼續(xù)在4 °C、10000?12000 r/min離心15?25 min，取上清液用0.22 μπι微孔濾膜過(guò)濾除去不溶性雜質(zhì)。將濾液裝入分子截留量為8 000的透析袋中，用Tris-HCKpH 7.6)緩沖液于4 °C下透析24?48 h，透析袋內(nèi)溶液即為赤魟軟骨總蛋白粗提物。
[0007])赤魟軟骨丙酮分級(jí)沉淀蛋白的制備:取赤魟軟骨總蛋白粗提物在冰浴下緩慢加入預(yù)冷丙酮至丙酮濃度為30%，在-20 °C下靜置4?6 h后，于4 °C、10000?12000 r/min高速離心20 min，取上清液，加入預(yù)冷丙酮至溶液最終丙酮濃度為60%，獲得赤魟軟骨60%丙酮沉淀蛋白，凍干，即為60%丙酮分級(jí)沉淀蛋白。
[0008])赤魟軟骨丙酮分級(jí)沉淀蛋白的酶解:取赤魟軟骨60%丙酮分級(jí)沉淀蛋白按照料液比Ig: 3?5 mL溶于Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH 7.5?8.5)，按照60%丙酮分級(jí)沉淀蛋白重量的2.0?3.0%加入胰蛋白酶(1.9X 14 U/g)，于40 °C酶解3?5 h，然后于90 °C、10 min滅酶活，酶解液于4 °C、10000?12000 r/min離心15?25 min，棄殘?jiān)占锨逡?，得軟骨蛋白酶解液?br>[0009])赤魟軟骨蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，凍干，得超濾酶解物;將超濾酶解物次經(jīng)離子交換樹(shù)脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得抗氧化肽。
[00?0] 作為優(yōu)選，所述的步驟I)中的赤魟為赤魟(Dasyatis akajei)。
[0011]作為優(yōu)選，所述步驟4)的離子交換樹(shù)脂層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過(guò)程為:
離子交換樹(shù)脂層析:將上述超濾酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)DEAE-52離子交換樹(shù)脂層析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測(cè)，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強(qiáng)組分凍干，即為離子交換層析酶解物；
凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠Sephadex G_15柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測(cè)，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強(qiáng)組分凍干，即為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80?100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除活性得I個(gè)高活性抗氧化肽Ile-Glu-Pro-His (IEPH)，ESI_MS測(cè)定分子量為494.55 Da。
[0012]再優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量10?15 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX
4.6mm,5 μπι)；流動(dòng)相:水-乙腈梯度洗脫(O?32min乙腈濃度由O勻速升至50%);洗脫速度0.6~1.0 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。
[0013]本發(fā)明還提供赤魟軟骨蛋白抗氧化肽的用途:由于其具有安全無(wú)毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，因而可以作為藥品、保健食品和食品的添加劑。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的赤魟軟骨蛋白抗氧化肽對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時(shí)，Ile-Glu-Pr0-His (IEPH)亦顯示出良好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用；Ile-Glu-Pro-His (ΙΕΡΗ)具有安全無(wú)毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品和食品的添加劑。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是本發(fā)明的DEAE-52離子交換樹(shù)脂層析圖。
[0016]圖2是本發(fā)明的葡聚糖凝膠SephadexG_15層析圖。
[0017]圖3葡聚糖凝膠SephadexG-15制備酶解物的RP-HPLC^H
[0018]圖4Ile-Glu-Pro-His (IEPH)的質(zhì)譜圖。
[0019]圖5Ile-Glu-Pro-His (IEPH)的抗脂質(zhì)氧化能力。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0021 ] 實(shí)施例:
赤魟軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:赤魟軟骨〃軟骨總蛋白〃軟骨60%丙酮沉淀蛋白〃胰蛋白酶酶解〃酶解物〃超濾〃離子交換層析〃凝膠過(guò)濾層析〃高效液相色譜制備"抗氧化肽。
[0022])赤魟軟骨總蛋白粗提物的制備:稱取孔鰩軟骨切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機(jī)中勻漿至糊狀，將糊狀的赤魟軟骨浸于5倍體積的1.0 mol/L鹽酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7.0)，于4 °C下攪拌抽提48 h。提取液在4 °C下以4500 r/min離心20 min，棄殘?jiān)占锨逡?上清液繼續(xù)在4 °C ^ 12000 r/min離心2011^11，取上清液用0.22 Mi微孔濾膜過(guò)濾除去不溶性雜質(zhì)。將濾液裝入分子截留量為8 000的透析袋中，用Tris-HCl(pH 7.6)緩沖液于4 °C下透析48 h，透析袋內(nèi)溶液即為赤魟軟骨總蛋白粗提物。
[0023])赤魟軟骨丙酮分級(jí)沉淀蛋白的制備:取赤魟軟骨總蛋白粗提物，在冰浴下緩慢加入預(yù)冷丙酮至丙酮濃度為30%，在-20 °C下靜置5 h后，于4 0Ca2000 r/min高速離心20min，取上清液，加入預(yù)冷丙酮至溶液最終丙酮濃度為60%，獲得赤魟軟骨60%丙酮沉淀蛋白，凍干，得60%丙酮分級(jí)沉淀蛋白。
[0024])赤魟軟骨丙酮分級(jí)沉淀蛋白的酶解:取赤魟軟骨60%丙酮分級(jí)沉淀蛋白按照料液比Ig:4mL溶于Tris-鹽酸緩沖液(0.05mol/L,pH 8.0)，按照60%丙酮分級(jí)沉淀蛋白重量的2.5%加入胰蛋白酶(I.9Χ 14 U/g)，于40 °C酶解4 h，然后于90 °C、10 min滅酶活，酶解液于4 0C ,12000 r/min離心20 min，棄殘?jiān)占锨逡?，得軟骨蛋白酶解液?br>[0025])赤魟軟骨蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分(DP60-1)，得到超濾酶解液，將超濾酶解液依次經(jīng)離子交換樹(shù)脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得抗氧化肽。
[0026]①離子交換樹(shù)脂層析:將DP60-1溶于雙蒸水配成濃度為50mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)DEAE-52離子交換樹(shù)脂層析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為0.6 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測(cè)，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥自由基清除能力，選擇抗氧化能力最強(qiáng)組分凍干，即為離子交換層析酶解物DP60-3(圖1);
②凝膠柱層析:將DP60-3溶于雙蒸水配成濃度為50mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于280 nm檢測(cè)，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥自由基清除能力，選擇抗氧化能力最強(qiáng)組分凍干，即為凝膠層析酶解物DP60-3-1 (圖2);
③RP-HPLC純化:將DP60-3-1用雙蒸水配成80?100yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化(RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量 15 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX4.6 mm,5 μπι);流動(dòng)相:水-乙腈梯度洗脫(O?32min乙腈濃度由O勻速升至50%);洗脫速度0.8 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm)，根據(jù)對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除活性得I個(gè)高活性抗氧化肽DCPE-B(圖3)。
[0027]④結(jié)構(gòu)檢測(cè):收集DPPH自由基和羥自由基清除活性最高的抗氧化肽DCPE-B，經(jīng)RP-HPLC檢測(cè)為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測(cè)定氨基酸序列為I Ie-Glu-Pr0-His(^卩!1)451-]^測(cè)定分子量為494.55 Da([M+H]+ 495.96 Da)(圖4)。
[0028]將制得的赤魟軟骨蛋白抗氧化肽Ile-Glu-Pro-His(ΙΕΡΗ)進(jìn)行自由基清除實(shí)驗(yàn)和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明= Ile-Glu-Pro-His (IEPH)對(duì)DPPH自由基(EC502.42 mg/mL)、輕基自由基(EC5。0.39 mg/mL)、ABTS自由基(ECso 0.11 mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC50 0.17 mg/mL);同時(shí)，I Ie-Glu-Pro-His (IEPH)亦顯示出良好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用(圖5)。
[0029]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.赤魟軟骨蛋白抗氧化肽，其特征在于:該抗氧化肽為四肽化合物，氨基酸序列為Ile-Glu-Pro-His，ES1-MS測(cè)定分子量為494.55 Da。2.赤魟軟骨蛋白抗氧化肽的用途，其特征在于:該抗氧化肽用于制備保健食品或食品添加劑的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種赤魟軟骨蛋白抗氧化肽及其用途。本發(fā)明以以赤魟軟骨為原料，通過(guò)總蛋白提取、丙酮分級(jí)沉淀、胰蛋白酶酶解得酶解液，酶解液采用超濾、離子交換樹(shù)脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜分離純化得到抗氧化肽Ile-Glu-Pro-His，ESI-MS測(cè)定分子量為494.55？Da；制備的高活性抗氧化肽對(duì)DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用，且有良好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用，具有安全無(wú)毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品或食品添加劑等。
【IPC分類(lèi)】A23L33/18, C07K5/103
【公開(kāi)號(hào)】CN105646651
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】王斌, 楊帆, 趙玉勤, 孫坤來(lái)
【申請(qǐng)人】浙江海洋學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2015年12月31日