一種奶牛金黃色葡萄球菌β-溶血素亞單位疫苗的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法及應(yīng)用。屬 于生物疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 奶牛乳房炎(Mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病，主要是奶牛乳腺組織受 到微生物感染而引起的一種炎癥，多發(fā)生于產(chǎn)后哺乳期，該病廣泛存在于世界各地，為奶牛 常見病、多發(fā)病，是造成乳制品業(yè)經(jīng)濟損失最為嚴重的疾病。引起奶牛乳房炎的病原微生物 大約有150多種，主要以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌為主，這三種細菌引起的奶 牛乳房炎占總發(fā)病率的90%以上，其中尤以金黃色葡萄球菌為最。
[0003] 當(dāng)前奶牛乳房炎的治療方法主要是采用抗生素治療，抗生素用于治療奶牛乳房炎 已有50多年的歷史了，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于長期單一的、大劑 量的不科學(xué)使用抗生素，引起了敏感性細菌的消除，耐藥性細菌逐漸占了主流，尤其是金黃 色葡萄球菌的耐藥問題日益嚴重，導(dǎo)致了抗生素治療收效甚微。
[0004] 用疫苗來防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以預(yù)防奶牛感染病原菌 而引起乳房炎;其次，疫苗有助于降低乳腺感染的嚴重程度，控制亞臨床型乳房炎;第三，使 用疫苗防治乳房炎不會存在乳汁中抗生素殘留問題;最后是操作簡便，費用低廉。當(dāng)前，研 制成功的疫苗很少，且大都數(shù)為弱毒活菌苗或滅活菌苗，在生產(chǎn)實踐中，對乳房炎的防治有 一定作用，然而隨著大規(guī)模集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，人工致弱菌株存在著同源重組、自身毒力返 強等潛在可能，而滅活疫苗也存在使用劑量大、免疫期短等不足，為提高傳統(tǒng)疫苗的安全性 與免疫保護力，高效、廉價的新型疫苗研制極其重要。
[0005] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，簡稱SA)，也稱"金葡菌"，是一種革蘭 氏染色陽性的球菌，直徑〇.8μπι，在顯微鏡下排列成葡萄串狀，并可以產(chǎn)生金黃色的色素，并 因此而得名。金葡菌是引起慢性/隱性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以極大的影響牛奶 的產(chǎn)量和質(zhì)量，給奶制品產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。有研究表明，金黃色葡萄球菌分泌的β 溶血素是導(dǎo)致奶牛乳房炎的一個致病因子。
[0006] 金葡菌可產(chǎn)生多種毒素和酶。β溶血素（亦稱β-toxin)就是其毒素之一，它具有白 細胞毒性、溶血活性等特性。β溶血素是由330個氨基酸組成的單鏈多肽，分子量為37~ 39kDa，其等電點(pi)高于9。0溶血素是一種鎂依賴神經(jīng)酯酶，具有磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)活性，可以分解甘油磷酸膽堿，β溶血素依靠這種酶活性，水解組成細胞膜的磷脂雙 分子層，從而破壞細胞膜的完整性，導(dǎo)致細胞裂解，引起溶血。將β溶血素進行定點突變后， 突變體就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直接用來免疫動 物，是金葡菌亞單位疫苗的重要候選蛋白之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種奶牛金黃色葡萄球菌β-溶血素亞單位疫苗的制備方 法及應(yīng)用。重組蛋白與合適佐劑混合制備的亞單位疫苗與致病菌的自然感染過程相似，可 促進細胞免疫，誘導(dǎo)免疫記憶和引起廣泛的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生很好的交叉保護反應(yīng)，是一種更 加安全穩(wěn)定、制備簡單、應(yīng)用方便、價格低廉的新型疫苗。
[0008] 所述的重組β-溶血素蛋白來自金黃色葡萄球菌，編碼該蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。
[0009] 本發(fā)明還提供一種奶牛金黃色葡萄球菌β-溶血素亞單位疫苗的制備方法，主要包 括以下步驟：1)定點突變金黃色葡萄球菌溶血素蛋白基因；2)將定點突變的β-溶血素蛋 白基因克隆到pET28a載體中；3)將步驟2)獲得的表達載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，誘導(dǎo)表 達獲得重組β-溶血素蛋白；4)使用鎳柱親和層析純化步驟3)得到的重組β-溶血素蛋白；5) 將純化得到的重組β-溶血素蛋白與藥學(xué)上可接受的佐劑(如ISA 206VG佐劑)充分混勻后得 到奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎重組亞單位疫苗。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下：奶牛乳房炎亞單位疫苗即利用 致病菌主要的保護性免疫原制成不含有核酸、能誘發(fā)機體產(chǎn)生抗體的疫苗，將其直接注入 機體而激活免疫系統(tǒng)，以達到預(yù)防和治療疾病的目的。重組蛋白與合適佐劑混合制備的亞 單位疫苗與致病菌的自然感染過程相似，可促進細胞免疫，誘導(dǎo)免疫記憶和引起廣泛的免 疫應(yīng)答，產(chǎn)生很好的交叉保護反應(yīng)，是一種更加安全穩(wěn)定、制備簡單、應(yīng)用方便、價格低廉， 且省時省力具有顯著療效的新型疫苗。
【附圖說明】
[0011] 圖1、β-溶血素分段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，M:Marker DL2，000; 1是β溶血素 定點突變片段I (509bp)，2是β溶血素定點突變片段2(468bp)。
[0012] 圖2、β-溶血素定點突變重疊PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，M:Marker DL5,000;1是β溶 血素定點突變重疊PCR產(chǎn)物(936bp)。
[0013]圖3、β-溶血素定點突變重組質(zhì)粒酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，M:Marker DL5， 000;1是pET28a-i3溶血素定點突變3號質(zhì)粒(NdeI/XhoI)，2是pET28a-i3溶血素定點突變4號 質(zhì)粒(Ndel/Xhol)。
[0014] 圖4、β-溶血素鎳柱親和層析純化結(jié)果，F(xiàn)T: f Iow through; 50mM: 50mM咪唑；IOOmM: I OOmM咪唑；150mM: 150mM咪唑。
[0015] 圖5、重組β-溶血素蛋白復(fù)性結(jié)果。
[0016] 圖6、ELISA檢測β-溶血素亞單位疫苗免疫小鼠后效價結(jié)果。
[0017] 圖7、免疫攻毒后小鼠存活率實驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1表達載體pET28a-i3-溶血素定點突變的構(gòu)建
[0019] 以臨床分離到的奶牛金黃色葡萄球菌基因組為模板，將β-溶血素分成兩段進行 PCR，結(jié)果如圖1所示。
[0020] 1 · 1加樣體系為(50μ1):
[0021]
[0022] 1.3膠回收DNA片段：
[0023] (1)將步驟1.2的反應(yīng)液進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳(110V 30min);
[0024] (2)在紫外燈下，切膠回收DNA片段于1.5ml EP管中；
[0025] (3)向步驟（2)中的 1.5ml EP管中加入500μ1 PC buffer，5(TC，水浴IOmin;
[0026] (4)將步驟(3)中溶液移至吸附柱中心，靜置2min，離心，12,000rpm，30s;
[0027] (5)棄廢液，向吸附柱中心加入600μ1 PW buffer，靜置3min，12,000rpm，30s;
[0028] (6)重復(fù)步驟(5);
[0029] (7)空吸附柱離心，12,000rpm，lmin;
[0030] (8)向吸附柱中心加入30μ1 ddH2〇,靜置3min，離心（12,000rpm，2min);
[0031] (9)收集步驟(S)DNA樣品進行電泳。
[0032] 1.4重疊PCR，將β-溶血素進行定點突變，結(jié)果如圖2所示：
[0033] 加樣體系為(50μ1):
[0034] PCR擴增程序：
[0036] 在1.5ml EP管中按照步驟1.5進行加樣、混勻，而后將這兩個50μ1反應(yīng)液置于37°C 恒溫水浴鍋中，水浴3h。
[0037] 1.6膠回收DNA片段：
[0038] (1)將步驟1.5的反應(yīng)液進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳（110V 30min);
[0039] (2)在紫外燈下，切膠回收DNA片段于1.5ml EP管中；
[0040] (3)向步驟（2)中的 1.5ml EP管中加入500μ1 PC buffer，50°C，水浴IOmin;
[00411 (4)將步驟⑶中溶液移至吸附柱中心，靜置2min，離心，12，OOOrpm，30s;
[0042] (5)棄廢液，向吸附柱中心加入600μ1 PW buffer，靜置3min，12,000rpm，30s;
[0043] (6)重復(fù)步驟(5);
[0044] (7)空吸附柱離心，12 ,OOOrpm，Imin;
[0045] (8)向吸附柱中心加入30μ1 ddH2〇,靜置3min，離心（12,000rpm，2min);
[0046] (9)收集步驟(S)DNA樣品進行電泳。
[0047] 1.7連接反應(yīng)（1(^1體系）：
[0048] 在1.5ml EP管中按照上述體系進行加樣、混勻，而后將上述反應(yīng)液置于16 °C，水浴 16h后取出，65°C，水浴15min后進行滅活，將樣品4°C保存。
[0049] 1.8轉(zhuǎn)化實驗：
[0050] (1)取出步驟1.7的反應(yīng)液，向其中添加100μΙ E.coli DH50感受態(tài)細胞，混勻；
[0051 ] (2)冰浴 30min;
[0052] (3)42°C，水浴 100s;
[0053] (4)冰浴 2min;
[0054] (5)取出，向EP管中加入600μ1液體LB培養(yǎng)基，37°C，水浴Ih;
[0055] (6)取出，離心(8,000rpm，2min)，去掉600μ1，剩余100μΙ LB重懸菌體；
[0056] (7)取菌液鋪板于LK平板中（Kan濃度為50μg/ml)，將LK平板置于生化恒溫培養(yǎng)箱 中，37°C培養(yǎng)12h。
[0057] 1.9重組質(zhì)粒提取及酶切鑒定：
[0058] (1)從轉(zhuǎn)化平板中挑取單克隆至3ml LK液體培養(yǎng)基中，37°C，260rpm搖菌過夜；
[0059] (2)取Iml菌液至1.5ml EP管中，離心（12,000rpm，2min)，棄上清；
[0060] (3)向步驟(2)中的EP管中加入250μ1 Plbuff er，重懸菌體；
[0061 ] (4)向步驟(3)溶液中加入250μ1 P2buffer，溫和混勻，靜置2min;
[0062] (5)向步驟(4)溶液中加入350μ1 P3buffer，溫和混勻；
[0063] (6)將步驟(5)溶液，離心（12，OOOrpm，IOmin);
[0064] (7)將步驟(6)中的上清溶液移至吸附柱中心，離心(8，OOOg，30s);
[0065] (8)棄廢液，向吸附柱中心加入500μ1 wash buffer，離心（9,000g，30s);
[0066] (9)重復(fù)步驟(8);
[0067] (10)空吸附柱離心(9,000g，lmin);
[0068] (11)吸附柱中加入30μ1 Elution buffer，靜置2min，離心（12,000rpm，2min);
[0069] (1