br>【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和 形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 1、材料
[0030]巨尾桉廣林29桉樹品種由廣西田園生化股份有限公司提供。
[0031 ]實(shí)驗(yàn)例1巨尾桉廣林29品種的組培快繁 [0032] 1、材料與方法
[0033] 1.1材料
[0034] 以在花盆中栽種的巨尾桉廣林29桉樹苗的樹冠頂部枝條作為組培外植體材料。 [0035] 1.2外植體選擇及處理
[0036]選取當(dāng)年扦插枝條的中上部4~7節(jié)莖段，頂芽以下4~6位腋芽及半木質(zhì)化的莖段 為外植體。剪去所有葉片，僅腋芽處留少許葉柄，在自來水下沖洗干凈，剪成帶有3~4個(gè)腋 芽的莖段。在超凈工作臺(tái)中用75%酒精（體積分?jǐn)?shù)）消毒1分鐘，無菌水漂洗3~5次;再用 0.1%氯化汞(質(zhì)量分?jǐn)?shù))輕柔振蕩消毒5~10分鐘，無菌水漂洗5~6次，然后用無菌濾紙吸 干莖段表面水分，先切除掉莖段兩端受損的部位，再將莖段切成0.5~1.0 厘米，帶有獨(dú)立腋 芽的莖段，晾干后備用。
[0037] 1.3腋芽誘導(dǎo)
[0038] 將無菌處理的帶有獨(dú)立腋芽的桉樹莖段接種到MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+ Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L，pH 5.8-6.0培養(yǎng)基上，每瓶接種2-3個(gè)，散光培養(yǎng) 20-30d，到腋芽萌發(fā)。其中，培養(yǎng)基中添加適量的Vc可有效的遏制培養(yǎng)材料褐化及死亡;MS 培養(yǎng)基參見文獻(xiàn)Murashige T&Skoog F(1962)A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissues cultures.Physiol.Planta.15:473-479。
[0039] 1.4芽伸長(zhǎng)及增殖誘導(dǎo)
[0040] 1.4. IKT對(duì)芽苗增殖的影響
[00411待腋芽轉(zhuǎn)綠，長(zhǎng)至1.0~1.5厘米時(shí)，切取萌發(fā)的腋芽到未添加 KT增殖培養(yǎng)基① MS+ 6_1^0.511^/1^+祖厶0.0211^/1^+￥。10011^/1^+鹿糖308/]^：)]15^&86138/1^，卩!15.8-6.0和添加 適量KT的增殖培養(yǎng)基②MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.02mg/L+KT 0.05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖 30g/L+Phytagel 3g/L，pH 5.8-6.0上，進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)。對(duì)添加 KT和未添加 KT的增殖培養(yǎng) 上芽苗生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察和結(jié)果統(tǒng)計(jì)。
[0042]在繼代增殖培養(yǎng)過程中不可過早切取萌生芽，不利于芽增殖叢生分化;待芽開始 有些半木質(zhì)化，過晚轉(zhuǎn)移繼代萌生芽，芽增殖效率明顯降低，也不利于叢生芽分化。增殖培 養(yǎng)以光照16小時(shí)/天，光強(qiáng)2500-40001X，溫度維持在25-28攝氏度為宜，每20~30天繼代一 次到相同培養(yǎng)基上。經(jīng)過兩次繼代培養(yǎng)即可獲得大量桉樹無菌苗，可進(jìn)行生根誘導(dǎo)用于組 培育苗造林，也可為桉樹轉(zhuǎn)化再生系統(tǒng)的建立提供充足穩(wěn)定的無菌苗材料。
[0043] 1.5生根誘導(dǎo)
[0044] 繼代增殖到一定數(shù)量時(shí)，將株高2.0厘米以上有效芽苗切成單株，接種到生根培養(yǎng) 基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)。生根培養(yǎng)基采用1/2MS+NAA 0~0.1mg/L+IBA 0.2~0.5mg/L，pH 5.8- 6.0。生根培養(yǎng)先在弱光條件下培養(yǎng)10~15天，再將光照由弱加強(qiáng)。
[0045] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0046] 2. IKT對(duì)幼芽增殖的影響
[0047]在增殖培養(yǎng)過程中，在其他條件相同的培養(yǎng)條件下，在繼代增殖培養(yǎng)基中添加適 量KT對(duì)芽苗生長(zhǎng)和增殖的綜合效果較好，有效芽苗數(shù)多，比未添加 KT的增殖培養(yǎng)基獲得的 苗數(shù)提高66.7 %，增殖系數(shù)可達(dá)4.0以上，且芽苗健壯，整齊度高(表1)。而未添加 KT的增殖 培養(yǎng)基上的有效芽苗數(shù)顯著少，且芽苗長(zhǎng)勢(shì)瘦弱，葉片發(fā)黃，生根率低。
[0048]表1 KT對(duì)幼芽增殖的影響

[0051 ]注:增殖系數(shù)=有效苗數(shù)/接種苗數(shù)；
[0052] 增殖效率:已分化的芽苗總數(shù)(有效芽苗和無效芽苗)/接種外植體總數(shù)；
[0053] 有效芽苗:株高2.0厘米以上的芽苗。
[0054]實(shí)驗(yàn)例2最佳增殖培養(yǎng)基篩選
[0055] 按照實(shí)施例1方法進(jìn)行巨尾桉廣林29的外植體選擇及處理，將無菌處理的帶有獨(dú) 立腋芽的桉樹莖段接種到MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+ Phytagel 3g/L，pH 5 · 8-6 · 0培養(yǎng)基上，每瓶接種2-3個(gè)，散光培養(yǎng)20-30d，到腋芽萌發(fā)。
[0056] 切取腋芽至增殖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化叢生芽。為更好的確定有效激素濃度，在基礎(chǔ)的 MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加不同濃度梯度的6_BA(0 · 5mg/L、1 · Omg/L、1 · 5mg/L、2 · Omg/L)、NAA (0·02mg/L、0·05mg/L、0·lmg/L、0·15mg/L)、KT(0.02mg/L、0·05mg/L、0·lmg/L、0·15mg/L)三 種激素，以確定針對(duì)廣29桉樹最佳的增殖培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)以光照16小時(shí)/天，光強(qiáng)2500-40001x，溫度維持在25-28攝氏度為宜，每20~30天繼代一次到相同培養(yǎng)基上，觀察誘導(dǎo)結(jié) 果，統(tǒng)計(jì)并分析各處理的出芽數(shù)及芽苗生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
[0057]本發(fā)明在MS+蔗糖30g/L+Vc lOOmg/L+Phytagel 3g/L的固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，附加 不同激素組合對(duì)桉樹幼芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)。結(jié)果表明，在0.05~0. lmg/L范圍內(nèi)，隨著KT激素 使用量的增加，對(duì)增殖效率有較理想的促進(jìn)作用。其中，MS+KT 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L+ NAA 0.02mg/L+蔗糖30g/L組合的增殖系數(shù)最高，達(dá)到5.03，比其他激素組合培養(yǎng)基培養(yǎng)的 增殖系數(shù)高19.2個(gè)百分點(diǎn)以上;增殖效率快，增殖時(shí)間比其他激素組合培養(yǎng)基縮短10天以 上;而且芽苗生長(zhǎng)狀態(tài)良好，有效芽苗數(shù)多，芽苗莖節(jié)長(zhǎng)，平均芽長(zhǎng)比其他處理長(zhǎng)38%以上。
[0058] 因此，本發(fā)明確定培養(yǎng)基MS+KT 0.05mg/L+6-BA 1.011^/1+祖六0.0211^/1+蔗糖308/ 1^￥。10011^/1+?1^丨&86138/1，？!15.8-6.0為廣29桉樹最佳的芽增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0059] 表2增殖培養(yǎng)基對(duì)叢生芽生長(zhǎng)的影響
[0061 ]注：
[0062] V，表示差;叢生芽長(zhǎng)勢(shì)瘦弱，莖節(jié)短，葉片發(fā)黃；
[0063] "++"表示一般;叢生芽生長(zhǎng)較好，芽苗不整齊，葉色略發(fā)黃；
[0064] "+++"表示良好;叢生芽生長(zhǎng)良好，芽苗壯、整齊，莖節(jié)長(zhǎng)，葉片深綠；
[0065] 有效芽苗:株高1.0厘米以上為有效芽苗；
[0066] 平均增殖時(shí)間：為從腋芽接種至達(dá)到所述增殖系數(shù)的平均時(shí)間。
[0067] 實(shí)施例1巨尾桉廣林29品種的組培快繁
[0068] 1 · 1材料
[0069] 以在花盆中栽種的巨尾桉廣林29桉樹苗的樹冠頂部枝條作為組培外植體材料。
[0070] 1.2外植體選擇及處理
[0071] 選取當(dāng)年扦插枝條的中上部4~7節(jié)莖段，頂芽以下4~6位腋芽及半木質(zhì)化的莖段 為外植體。剪去所有葉片，僅腋芽處留少許葉柄，在自來水下沖洗干凈，剪成帶有3~4個(gè)腋 芽的莖段。在超凈工作臺(tái)中用75%酒精（體積分?jǐn)?shù)）消毒1分鐘，無菌水漂洗3~5次;再用 0.1%氯化汞(質(zhì)量分?jǐn)?shù))輕柔振蕩消毒5~10分鐘，無菌水漂洗5~6次，然后用無菌濾紙吸 干莖段表面水分，先切除掉莖段兩端受損的部位，再將莖段切成〇. 5~1.0厘米，帶有獨(dú)立腋 芽的莖段，晾干后備用。
[0072] 1.3腋芽誘導(dǎo)
[0073] 將無菌處理的帶有獨(dú)立腋芽的桉樹莖段接種到MS+6-BA Omg/L+NAA 0mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+Phytage I 3g/L，pH 5 · 8-6 · O培養(yǎng)基上，每瓶接種2-3個(gè)，散光培養(yǎng)20-30d，到腋芽萌發(fā)。培養(yǎng)基中添加適量的Vc可有效的遏制培養(yǎng)材料褐化及死亡。
[0074] 1.4芽伸長(zhǎng)及增殖誘導(dǎo)
[0075] 待腋芽轉(zhuǎn)綠，長(zhǎng)至1.0~1.5厘米時(shí)，切取萌發(fā)的腋芽到增殖培養(yǎng)基MS+KT 0.05mg/ 1^+6_1^1.〇11^/1^+熟厶0.0211^/1^+鹿糖3(^/1^+￥。10〇11^/]^4：)115^&86138凡，卩!15.8-6.0，進(jìn)行 叢生芽誘導(dǎo)。
[0076] 增殖培養(yǎng)以光照16小時(shí)/天，光強(qiáng)2500-40001X，溫度維持在25-28攝氏度為宜，每 20~30天繼代一次到相同培養(yǎng)基上。經(jīng)過兩次繼代培養(yǎng)即可獲得大量桉樹無菌苗，有效芽 苗數(shù)多，增殖系數(shù)可達(dá)