一種泛生菌酰胺酶、基因、載體、工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種編碼酰胺酶的基因、編碼酶蛋白、含有該基因的重組載體以及轉(zhuǎn) 化得到的重組基因工程菌及其在催化1-氰基環(huán)己基乙酰胺合成加巴噴丁關(guān)鍵中間體1-氰 基環(huán)己基乙酸中的應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 加巴噴丁，化學(xué)名為1_(氨甲基)環(huán)己基乙酸（I)，是由美國Warner-Lambert公司開 發(fā)的癲癇治療藥物，其后又被用于神經(jīng)病理性疼痛的治療。與當(dāng)前同類藥物相比，加巴噴丁 在口服吸收、毒副作用、耐受性以及治療效果等方面具有優(yōu)勢(shì)顯著。而且加巴噴丁在體內(nèi)不 易代謝，不誘導(dǎo)產(chǎn)生肝酶，與其它抗癲癇藥物極少相互作用。因此，加巴噴丁在癲癇治療藥 物市場(chǎng)中占有重要地位。
[0003] 盡管加巴噴丁分子結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，但其為兩性分子(既有-nh2又有-C00H)，極易形 成五元環(huán)內(nèi)酯。目前，已報(bào)道的加巴噴丁合成路線一般以環(huán)己酮為起始原料，經(jīng)全化學(xué)法合 成(US2003009055A，DE2543821，EP414262A)。如環(huán)己酮經(jīng)環(huán)合、水解、縮合、氨解和 Hoffmann 降解等步驟得到加巴噴丁 (W02003002504，W02003002517)。但該工藝會(huì)產(chǎn)生大量酸性廢液， 且產(chǎn)物需用離子交換分離，成本較高。此外，以非環(huán)己酮的六元環(huán)化合物如苯甲腈為起始原 料的工藝，由于原料價(jià)格高，反應(yīng)條件苛刻，工業(yè)化開發(fā)價(jià)值低。
[0004] 區(qū)域選擇性水解脂環(huán)族α，ω-二腈化合物1-氰基環(huán)己基乙腈（Π )可獲得加巴噴丁 關(guān)鍵中間體1-氰基環(huán)己基乙酸（m)，該中間體經(jīng)一步催化加氫即得到終產(chǎn)品。該路線是目 前最為簡(jiǎn)便、綠色的加巴噴丁合成工藝之一 (US20050009154)。但該催化工藝底物濃度低， 反應(yīng)時(shí)間長，2.96g/L底物經(jīng)22h催化，轉(zhuǎn)化率為97%。此外，專利0呢01410053739.9報(bào)道了 紅球菌ZJB1208腈水合酶區(qū)域選擇性催化1-氰基環(huán)己基乙腈合成1-氰基環(huán)己基乙酰胺(IV) 的工藝。但在化學(xué)水解1-氰基環(huán)己基乙酰胺合成1-氰基環(huán)己基乙酸時(shí)，該分子中的氰基和 酰胺基團(tuán)易同時(shí)被水解。因此，酰胺酶催化水解1-氰基環(huán)己基乙酰胺成為合成1-氰基環(huán)己 基乙酸的首選方法。
[0005]
[0006] 酰胺酶(Amidase，EC 3.5.1.4)是一類可催化各類天然、非天然酰胺類化合物水解 生成相應(yīng)羧酸的水解酶。由于具有良好的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，以及寬廣的底物譜，酰 胺酶在醫(yī)藥化工行業(yè)的應(yīng)用前景廣闊。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的是提供一種酰胺酶基因、含有該酰胺酶基因的重組載體、該重組載體 轉(zhuǎn)化得到的基因工程菌和表達(dá)得到的重組酰胺酶，及其在催化1-氰基環(huán)己基乙酰胺水解合 成1-氰基環(huán)己基乙酸中的應(yīng)用，為腈水合酶/酰胺酶耦聯(lián)催化合成加巴噴丁關(guān)鍵中間體奠 定基礎(chǔ)，解決目前腈水解酶選擇性水解路線所存在的催化劑用量過大，反應(yīng)時(shí)間過長等問 題。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明提供一種泛生菌酰胺酶，所述酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。任 何對(duì)SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列中氨基酸經(jīng)過缺失、插入或替換一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具 有酰胺酶活性的，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010] 本發(fā)明還提供一種所述泛生菌酰胺酶的編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0.2所示。該酰胺酶基因通過分子生物學(xué)手段人工合成，具體的篩選方法為根據(jù)酰 胺酶標(biāo)簽(Amidase signature，AS)家族及腈水解酶(Nitrilase superfamily，NF)家族酰 胺酶保守序列針對(duì)性地尋找NCBI收錄的氨基酸序列，進(jìn)一步篩選可匹配催化三聯(lián)體的蛋 白。最終確定了一個(gè)酰胺酶(GenBank accession NO.WP_008109374)，該酰胺酶來源于泛生 菌(Pantoea Sp.YR343)，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示。依據(jù)該氨基酸序列推 測(cè)編碼該酰胺酶的基因，并根據(jù)大腸桿菌偏好的密碼子對(duì)該基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，通過基 因工程的常規(guī)操作以全合成的方法合成了該段酰胺酶基因 pa-ami，為方便重組酰胺酶的分 離純化，在該基因末端加入表達(dá)組氨酸標(biāo)簽的核苷酸序列，全長1445bp，其核苷酸序列如序 列表中SEQ ID N0.2所示。
[0011] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，本發(fā)明的酰胺酶基因核苷酸序列也可以是編碼序列表中 SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的其它任何核苷酸序列。
[0012] 任何對(duì)SEQ ID N0.2所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入 處理獲得的核苷酸序列，只要其與核苷酸具有90%以上的同源性，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0013] 本發(fā)明還涉及一種由所述泛生菌酰胺酶編碼基因構(gòu)建的重組載體。這些重組載體 可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明的泛生菌酰胺酶核苷酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成。 所述載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如各種質(zhì)粒、噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選pET_28a。較 佳地，可通過下述方法獲得本發(fā)明的重組表達(dá)載體:將通過PCR擴(kuò)增所得的酰胺酶基因產(chǎn)物 pa-ami與載體pUC57連接形成克隆載體。該克隆載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nco I/Hindm雙酶切， 切膠回收后與同樣經(jīng)酶切處理回收的pET-28a連接，構(gòu)建本發(fā)明的酰胺酶基因重組表達(dá)質(zhì) 粒pET28a-Pa-Ami。
[0014] 本發(fā)明還涉及一種由所述重組載體轉(zhuǎn)化獲得的重組基因工程菌，可通過將本發(fā)明 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中獲得。所述的宿主微生物可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主 微生物，只要滿足重組表達(dá)載體可以穩(wěn)定自我復(fù)制且所攜帶的本發(fā)明的酰胺酶基因可以有 效表達(dá)。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌，更優(yōu)選大腸桿菌E. co 1 i BL21 (DE3)。將重組質(zhì)粒pET28a-Pa-Ami轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中，獲得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami。
[0015] 本發(fā)明還涉及一種所述泛生菌酰胺酶編碼基因在制備泛生菌酰胺酶中的應(yīng)用，所 述的應(yīng)用為:構(gòu)建含泛生菌酰胺酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至宿主菌中，獲得 的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離純化，獲得含泛生菌酰胺酶的菌體細(xì)胞。所述 的培養(yǎng)重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體所用的培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域可使轉(zhuǎn)化體生長并產(chǎn)生本發(fā)明的泛生 菌酰胺酶的培養(yǎng)基，優(yōu)選LB培養(yǎng)基:蛋白胨lOg/L，酵母膏5g/L，氯化鈉 lOg/L，溶劑為水，pH 7.0。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊限制，只要使轉(zhuǎn)化體能夠生長并產(chǎn)生酰胺酶即可。優(yōu)選 下述方法:將本發(fā)明涉及的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami接種至含卡那 霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的光密度0D6Q()達(dá)到0.5~0.7時(shí)，在終濃度為0.1~1. OmM 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)下，即可高效表達(dá)本發(fā)明的重組酰胺酶，具體 為:將構(gòu)建的工程菌E. co 1 i BL21 (DE3)/pET28a-Pa-Ami接種至含50yg/mL卡那霉素的LB液 體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，再以1%接種量(v/v)接種到含50yg/mL卡那霉素 LB培養(yǎng)基中， 37 °C，150rpm培養(yǎng)至菌體濃度0D6qq至0.6左右，加入終濃度為0.1 mM的IPTG，28 °C誘導(dǎo)培養(yǎng) 12h后，4°C，8000rpm離心10min，收集濕菌體。
[0016]此外，本發(fā)明提供一種所述泛生菌酰胺酶在生物催化1-氰基環(huán)己基乙酰胺制備1-氰基環(huán)己基乙酸中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用為：以含泛生菌酰胺酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培 養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以1-氰基環(huán)己基乙酰胺為底物，以pH 6~10的緩沖液為反應(yīng)介 質(zhì)，在25~45°C進(jìn)行水解反應(yīng)，反應(yīng)完全后，獲得含1-氰基環(huán)己基乙酸的混合液，將混合液 分離純化，獲得1-氰基環(huán)己基乙酸。所述的底物終濃度以緩沖液體積計(jì)為80~120g/L緩沖 液，所述濕菌體用量以緩沖液體積計(jì)為1~2g/L緩沖液。
[0017] 進(jìn)一步，優(yōu)選的底物終濃度以緩沖液體積計(jì)為100g/L緩沖液，所述濕菌體用量以 緩沖液體積計(jì)為2g/L緩沖液。
[0018] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述的緩沖液為0 · 02~0 · lmol/L，pH 8 · 0~8 · 5的Tris-HCl緩沖液， 最優(yōu)選pH=8.5,50mM Tris-HCl緩沖液。
[0019] 本發(fā)明所述含1-氰基環(huán)己基乙酸的混合液分離純化的方法為:反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng) 液于12,000rpm下離心10min去除菌體，用1M HC1將上清液調(diào)至pH 2.0,抽濾獲得1-氰基環(huán) 己基乙酸粗品。粗品經(jīng)重結(jié)晶后于50~60°C烘干，獲得1-氰基環(huán)己基乙酸。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明獲得了一株可高效催化 1-氰基環(huán)己基乙酰胺的酰胺酶工程菌，并首次報(bào)道了利用酰胺酶生物催化生成1-氰基環(huán)己 基乙酸的合成工藝，具有催化劑用量小(2g/L)，底物濃度高（100g/L)，反應(yīng)時(shí)間短(20min)， 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率達(dá)100%等顯著優(yōu)勢(shì)。 (四）
【附圖說明】
[0021] 圖1為酰胺酶基因瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，泳道1為DL2000 DNA Marker(從上至 下條帶大小分別為2000、1000、750、500、250、100bp);泳道2為酰胺酶基因片段；
[0022] 圖2為pET28a-Pa-Ami重組質(zhì)粒物理圖譜；
[0023]圖3為酰胺酶分離純化SDS-PAGE圖；泳道1為蛋白質(zhì)分子量Marker，泳道2為未誘導(dǎo) 的E · co 1 i BL21 (DE3)/pET28a-Pa-Ami，泳道3為IPTG誘導(dǎo)的E · co 1 i BL21 (DE3)/pET28a-Pa-Ami，泳道4為誘導(dǎo)后E. coli BL21 (DE3)/pET28a-Pa-Ami破碎上清，泳道5為純化后的Pa-Ami ；
[0024]圖4為酰胺酶催化1-氰基環(huán)己基乙酰胺水解生成1-氰基環(huán)己基乙酸的高效液相色 譜圖，保留時(shí)間4.72min為