一種乳制品中致病菌定量檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及食品微生物檢測領域，具體涉及一種食品微生物的快速檢測方法，尤其涉及一種乳制品中致病菌定量檢測方法。
【背景技術】
[0002]食品安全是一個世界性的影響人類健康的重大問題，其與人類生存環(huán)境和社會穩(wěn)定息息相關。其中細菌性食物中毒的危害最為嚴重，感染者輕可造成發(fā)熱、頭痛、腹痛、腹瀉和嘔吐，重則會出現(xiàn)肌肉痙攣，甚至休克直至死亡，因此微生物的檢驗成為食品檢測必不可少的重要組成部分，是衡量食品衛(wèi)生質量的重要指標之一，也是判定被檢食品能否食用的科學依據(jù)之一。通過食品微生物檢驗，還可以判斷食品加工衛(wèi)生環(huán)境，能夠對食品被細菌污染的程度做出正確的評價，為各項衛(wèi)生管理工作提供科學依據(jù)，提供傳染病和人畜食物中毒的防治措施。
[0003]據(jù)統(tǒng)計，目前導致細菌性食物中毒的細菌種類中，最常見的主要是沙門氏菌、單核細胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸桿菌等等。針對這些細菌及其他易危害人體健康的食品微生物，現(xiàn)有的檢測方法主要依賴于微生物富集培養(yǎng)-選擇性分離-生化鑒定方法，該方法存在手工操作繁瑣費時、檢測靈敏度低、易出現(xiàn)假陰性等缺陷，且衛(wèi)生指導反饋慢，給商品生產(chǎn)和流通帶來一定的影響。此外還有常用的免疫學方法和基因探針法，前者雖能彌補傳統(tǒng)方法的一些不足，但也有誤差大、周期長的局限性；而后者也存在檢測費用昂貴、實驗步驟多且費時的缺點。因此研究食品微生物快速、準確、經(jīng)濟的檢測方法以預防和控制食品安全事件的發(fā)生，具有重要的現(xiàn)實意義。
[0004]針對上述問題，近年來微生物學專家和工程技術人員密切合作，采用了各種物理化學及生物技術對如何快速準確經(jīng)濟的鑒定微生物進行了研究分析，如采用了光散射技術、發(fā)光技術、色譜技術、電氣電子技術、免疫技術及放射技術等，并基于上述分析技術發(fā)明了許多定性或定量鑒定微生物的分析方法。常見的有:(I)檢測某些細菌的專有酶及代謝產(chǎn)物進行快速鑒定；(2)應用免疫學方法檢測微生物抗原或抗體，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、熒光免疫分析(FIA)、化學發(fā)光免疫分析(CIA)、生物發(fā)光免疫分析(BIA)等；(3)細菌毒素的快速檢測；(4)細菌對抗菌藥物的敏感性試驗的快速檢測；(5)分子生物學技術在檢測微生物中的應用，如核酸探針(Nuclear acid probe)、聚合酶鏈反應(Polymerase chain react1n，PCR)、基因芯片技術(microarray)等；(6)快速檢測細菌生化反應及成套鑒定系統(tǒng)；(7)病原微生物的自動化系統(tǒng)，其中最有代表性的是AMS微生物自動分析系統(tǒng)。
[0005]目前應用最多的是采用多重PCR方法來進行食品中微生物的檢測，例如楊國興在多重PCR檢測肉及肉制品中四種食源性致病菌的研究中，根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc、沙門氏菌的侵染性質?？乖瑽基因ipaB、志賀氏菌的侵染性質?？乖璈基因ipaH、單核增生李斯特氏菌的內化素A基因inlA設計了四對特異性引物，進行多重PCR反應，可同時實現(xiàn)對四種食源性致病菌的檢測；試驗過程中對多重PCR反應體系中引物添加量、鎂離子濃度、dNTPmixture添加量及退火溫度和循環(huán)數(shù)等影響要素進行優(yōu)化，確定了適宜的多重PCR反應體系和擴增程序(參見楊國興，“多重PCR檢測肉及肉制品中四種食源性致病菌的研究”，中國優(yōu)秀碩士學位論文數(shù)據(jù)庫，2008年6月10日)；另外，蘇裕心在建立幾種食源性致病菌熒光定量PCR的檢測方法時，采用通過lambda噬菌體DNA標準物質候選物的制備研究，進行金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌、沙門氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌gDNA定量標準物質的制備研究；并利用SmartCycler系統(tǒng)建立一種高敏、特異、簡便、快速的qPCR檢測金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌、沙門氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌的方法，并在LightCycler 2.0，ABI 7300儀器上對所建立的體系進行評估(參見蘇裕心，“幾種食源性致病菌熒光定量PCR檢測方法的建立”，中國優(yōu)秀碩士學位論文數(shù)據(jù)庫，2010年5月26日)。從目前的研究來看，對于食品微生物進行多重PCR檢測時，主要集中在對PCR程序的改進上，其存在微觀、不易操作的缺陷，并對設備和實驗室的要求比較高，而且容易出現(xiàn)假陽性和假陰性樣本。
[0006]目前也有一些研究證實，通過調整混合培養(yǎng)基可以有效增殖致病菌，從而有助于定量檢測食品中的微生物，例如楊軍等研究了多重PCR法對乳制品中3種致病菌的同時快速檢測，其通過調整混合培養(yǎng)基的配比摸索了乳制品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的快速共增菌條件，使得3種致病菌在37°C搖床培養(yǎng)后濃度達到106/mL (參見楊軍等，“多重PCR法對乳制品中3種致病菌的同時快速檢測”，中國乳品工業(yè)，第38卷第4期，2010年4月25日)。然而，由于該研究只針對上述3種致病菌的檢測，其存在一定的局限性，而對于乳制品中的其它致病菌是否能夠進行同時快速檢測尚未知否。
[0007]上述各種方法與傳統(tǒng)檢測方法相比，在高效快速方面雖已具有較大的進步，但仍不能適應日益嚴格的食品質量檢測方面的高要求，無法滿足靈敏度高、特異性強、重復性大、快速、簡易和經(jīng)濟等要求。而且，上述各方法中PCR鑒定方法基本上具備了食品微生物檢驗新要求的各種條件，但在實際操作中仍會存在假陽性和無法判斷微生物活性狀態(tài)等問題，因此如何尋找一種靈敏度高、特異性好，經(jīng)濟、簡便的食品尤其是乳制品中致病菌的定量檢測方法是目前亟待解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的之一在于提供一種食品中致病菌的定量檢測方法，特別是乳制品中3種以上致病菌的同時快速檢測方法；通過該方法可以實現(xiàn)對乳制品尤其是巴氏殺菌乳和酸奶樣品中致病菌的檢測準確度和特異性都在99%以上，最低檢出限可達到ICFU/μ L，并有效縮短了檢測時間，實現(xiàn)了快速檢測。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過兩次定量取樣并根據(jù)PCR結果進行數(shù)據(jù)分析，能精確地在短時間內判斷出乳制品中致病菌的污染程度、活菌比例、致病菌活性狀況及污染歷史的檢測方法，為進一步毒素測定提供指導作用。
[0010]為達此目的，本發(fā)明采用以下技術方案:
[0011]第一方面，本發(fā)明提供了一種乳制品中致病菌定量檢測方法，其包括以下步驟:
[0012](I)將疑似含有目標致病菌的樣品通過非特異性培養(yǎng)進行致病菌的擴增；
[0013]其中，所述非特異性培養(yǎng)用到的培養(yǎng)基為月桂基硫酸鹽、GN培養(yǎng)基和質量分數(shù)為7.5%的NaCl肉湯按體積比為(1-3):1: (8-15)進行復配并添加濃度為0.2-0.5g/L的甘露醇和濃度0.2-0.4g/L的檸檬酸鐵銨而得到；
[0014](2)對所述擴增產(chǎn)物進行定量取樣，將所得樣品直接進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行Ct值的測定，然后根據(jù)Ct值進行數(shù)據(jù)處理并分析結果。
[0015]本發(fā)明是特異性針對乳制品中致病菌的定量檢測方法，尤其是針對巴氏殺菌乳和酸奶樣品中致病菌效果最好；其中致病菌可以是沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌或糞便鏈球菌中的任意三種或三種以上的組合，對每種致病菌的最低檢出限可達到ICFU/μ L。
[0016]本發(fā)明所述檢測方法的步驟(I)中所述非特異性培養(yǎng)用到的培養(yǎng)基為月桂基硫酸鹽、GN培養(yǎng)基和質量分數(shù)為7.5%的NaCl肉湯按體積比為(1-3):1:(8-15)進行復配并添加濃度為0.2-0.5g/L的甘露醇和濃度0.2-0.4g/L的檸檬酸鐵銨而得到。
[0017]本發(fā)明中所述月桂基硫酸鹽、GN培養(yǎng)基和質量分數(shù)為7.5%的NaCl肉湯三者進行復配的體積比為(1-3):1: (8-15)，例如可以是 1:1:8、1:1:9、1:1:10、1:1:11、1:1:12、1:1:13、1:1:14、1:1:15、2:1:8、2:1:9、2:1:10、2:1:11、2:1:12、2:1:13、2:1:14、2:1:15、3:1:8、3:1:9、3:1:10、3:1:11、3:1:12、3:1:13、3:1:14、3:1:15，優(yōu)選為 3:1: (10-15)，進一步優(yōu)選為3:1:14。
[0018]本發(fā)明中添加濃度為0.2-0.5g/L的甘露醇和濃度0.2-0.4g/L的檸檬酸鐵銨，甘露醇的濃度例如可以是 0.2g/L、0.22g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.4g/L、0.5g/L ;檸檬酸鐵銨的濃度例如可以是 0.2g/L、0.22g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.32g/L、0.35g/L、0.38g/L、0.4g/L0
[0019]采用本發(fā)明所述的非特異性培養(yǎng)基可以同時對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌和糞便鏈球菌中的三種或三種以上進行很好地擴增，相比常用的非特異性培養(yǎng)基，例如巰基乙酸鹽培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯、緩沖蛋白胨水以及GN培養(yǎng)基和質量分數(shù)為7.5%的NaCl肉湯的復配等，其通過各組分的相互配比和協(xié)同作用，能夠同時使各致病菌實現(xiàn)快速增殖，至少使各致病菌的增殖達到107/mL，達到一個很好的平衡培養(yǎng)，有利于后期的定量檢測。
[0020]優(yōu)選地，所述目標致病菌為沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌或糞便鏈球菌中的任意三種或三種以上的組合，優(yōu)選為沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌和糞便鏈球菌這6種的組合。
[0021]在步驟(I)所述擴增過程中，還包括分別在培養(yǎng)階段的零時刻和非零時刻進行兩次定量取樣；例如取樣的時間可以是6h、7h、8h、9h、10h、llh、12h、13h、14h、15h、15.5h、16h、16.5h、17h、17.5h、18h、18.5h、19h、19.5h、20h、21h、22h、23h、24h。
[0022]本發(fā)明只采用在兩個時刻進行定量取樣，一方面省