: 1和SEQ ID NO :3所示；
[0055] ②將步驟①所得基因序列克隆至克隆載體上，得到單增李斯特菌的質粒標準分 子。
[0056] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟②所述克隆載體為pUC19, pUC18, pUC118, pUC119， pBlueScript II SK 或 pGEM。
[0057] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟②所述克隆載體為pUC19。
[0058] 應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0059] 圖1是本發(fā)明質粒標準分子LYOl的圖譜。
[0060] 圖2是本發(fā)明所得質粒標準分子LYOl穩(wěn)定性檢測結果圖。
[0061] 圖3是利用本發(fā)明質粒標準分子LYOl建立的實時熒光PCR標準曲線。
[0062] 圖4是本發(fā)明質粒標準分子LY02的圖譜。
[0063] 圖5是本發(fā)明所得質粒標準分子LY02穩(wěn)定性檢測結果圖。
[0064] 圖6是利用本發(fā)明質粒標準分子LY02建立的實時熒光PCR標準曲線。
【具體實施方式】
[0065] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，獲得一段能夠用于單增李斯特菌PCR檢測的多 核苷酸序列以及與之相配合的引物對，實驗結果表明，采用合適的骨架質粒將所述多核苷 酸序列制備為標準質粒分子，并配合本發(fā)明的引物對進行實時熒光PCR檢測，具有極佳的 特異性和靈敏度，并且穩(wěn)定性良好。
[0066] 本發(fā)明所要解決的技術問題是為了克服現(xiàn)有的單增李斯特菌實時熒光PCR檢測 方法中缺乏陽性標準品和陽性標準品配置的問題，提供了一套適用于單增李斯特菌實時熒 光PCR檢測的質粒標準分子以及該質粒標準分子的構建方法、定量方法和應用。
[0067] 檢測菌株
[0068] 單核細胞增生李斯特菌（L. monocytogenes，LM)是食品衛(wèi)生上重要的病原菌，它 廣泛存在于自然界，可導致人和動物腦膜炎流產敗血癥等，病死率高達30 %~70 %，是目 前人類最重要的食物源性病原菌之一，WHO將其列為20世紀90年代食品中四大致病菌之 一，也被列為21世紀對中國人衛(wèi)生健康具有重大影響的12種病原微生物之一。
[0069] 單增李斯特菌轉錄激活調節(jié)蛋白基因 prfA基因（對應檢測質粒標準物質LY02) 是單增李斯特菌檢測的毒力因子。研究資料表明，編碼內化素的Inl基因是LM最重要的致 病基因，其位點在單增李斯特菌的染色體內，缺少即無致病性，因此，它們可以作為單增李 斯特菌菌種檢測的關鍵基因。
[0070] 實時熒光PCR檢測單增李斯特菌的原理
[0071] 采用實時熒光PCR技術可特異性擴增單增李斯特菌基因組DNA中內化素 InlA基 因序列或單增李斯特菌轉錄激活調節(jié)蛋白基因 PrfA基因序列，設計針對以上靶基因的引 物和兩端標記熒光的探針，擴增測試樣品DNA。實時熒光PCR可以通過檢測熒光信號的增加 來實時監(jiān)測PCR產物。與此同時，用相同的引物、探針和條件擴增已知濃度的陽性標準物質 (或陽性標準分子）。PCR方法中，陽性標準物質（或陽性標準分子）可以作為陽性對照； 實時熒光PCR中，陽性標準物質（或陽性標準分子）可以構建穩(wěn)定的標準曲線，根據(jù)標準曲 線可分別計算出樣品中對應基因的絕對含量（拷貝數(shù)或濃度）。
[0072] 標準物質
[0073] 標準物質是具有一套或多種足夠均勻和很好確定了的特性值，用以校準設備，評 價測量方法或給材料賦值的材料或物質。
[0074] 質粒標準分子
[0075] 本發(fā)明中涉及兩種檢測單增李斯特菌的特異性序列并在此基礎上設計了兩種質 粒標準分子，一種單增李斯特菌的特異性序列是單增李斯特菌內化素 InlA基因，長度為 2403bp ;另一套單增李斯特菌的特異性序列是單增李斯特菌轉錄激活調節(jié)蛋白基因 prfA 基因，長度為714bp。
[0076] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，本發(fā)明提供了一套單增李斯特菌的質粒標準 分子，該質粒標準分子包含單增李斯特菌轉錄激活調節(jié)蛋白基因 PrfA基因序列，所述單增 李斯特菌轉錄激活調節(jié)蛋白基因 PrfA基因序列如序列表中SEQ ID NO :1所示：
[0078] 本發(fā)明的質粒標準分子，較佳地含有單增李斯特菌的PCR檢測的靶基因單增李斯 特菌轉錄激活調節(jié)蛋白基因 PrfA基因序列。
[0079] 本發(fā)明中所述的單增李斯特菌轉錄激活調節(jié)蛋白基因 prfA基因，在DNA、RNA和蛋 白質的合成中起作用，它可作為單增李斯特菌檢測的一套靶基因，所述單增李斯特菌轉錄 激活調節(jié)蛋白基因 PrfA基因的序列較佳的如SEQ ID NO :1所示。
[0080] 本發(fā)明所述的質粒標準分子的序列較佳的如SEQ ID NO :2所示，其中第414位到 第1127位為prfA基因序列：
CN 105177127 A 說明書 6/21 頁
[0083] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選地實施方式中，本發(fā)明提供了一套單增李斯特菌的質粒標 準分子，該質粒標準分子包含單增李斯特菌內化素 InlA表達基因序列，所述單增李斯特菌 內化素 InlA表達基因序列如序列表中SEQ ID NO :3所示：
[0084] CN 105177127 A 說明書 7/21 頁
[0086] 本發(fā)明的質粒標準分子，較佳地含有單增李斯特菌的PCR檢測的靶基因單增李斯 特菌內化素 InlA表達基因序列。
[0087] 本發(fā)明中所述的單增李斯特菌內化素 InlA表達基因，在DNA、RNA和蛋白質的合成 中起作用，它可作為單增李斯特菌檢測的一套靶基因，所述單增李斯特菌內化素 InlA的序 列較佳的如SEQ ID NO :3所示。
[0088] 在本發(fā)明的另一個較佳的實施方式中，本發(fā)明所述的質粒標準分子的序列如SEQ ID NO :4所示，其中第414位到第2816位為InlA基因序列：
[0089] CN 105177127 A 說明書 8/21 頁

[0092] 在本發(fā)明的另一較佳的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的質粒標準分子中含有單增李斯 特菌轉錄激活調節(jié)蛋白基因 prfA基因序列和單增李斯特菌內化素 InlA基因序列。較佳地， 所述PrfA序列如SEQ ID NO. : 1所示，所述InlA序列如SEQ ID NO. : 3所示。
[0093] 本發(fā)明中如上所述單增李斯特菌的質粒標準分子的定量方法，其包括以下步驟：
[0094] ①提取質粒標準分子；
[0095] ②根據(jù)步驟①所得的質粒標準分子的堿基組成和序列長度，計算質粒標準分子中 的磷元素的含量；
[0096] ③配制梯度濃度的磷標準溶液，并用此標準溶液作出高分辨電感耦合等離子體發(fā) 射質譜的標準曲線；
[0097] ④高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質譜檢測質粒標準分子溶液，并根據(jù)步驟③所得 的標準曲線得出質粒標準分子溶液的磷含量；
[0098] ⑤根據(jù)步驟④所得的質粒標準分子溶液的磷含量和步驟②所得的質粒標準分子 中的磷元素的含量，計算出質粒標準分子的濃度。
[0099] 其中步驟所述③高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質譜檢測的條件如下：冷卻氣流 量較佳地為l〇L/min~25L/min，最佳地為16. 86L/min，輔助氣流量較佳地為0. 5L/min~ 3. OL/min，最佳地為0. 88L/min，霧化氣流量為較佳地為0. 5L/min~2. 43L/min，更佳地為 I. 123L/min，功率較佳地為1200W~1400W，最佳地為1350W。
[0100] 本發(fā)明所述質粒標準分子的定量方法較佳地包括紫外分光光度法和高分辨電感 耦合等離子體質譜（HR-ICP-MS)。
[0101] 具體實施說明：
[0102] 本發(fā)明所述質粒標準分子的定量方法較佳地包括紫外分光光度法和高分辨電感 耦合等離子體質譜（HR-ICP-MS)。
[0103] 其中紫外分光光度法對質粒標準分子定量方法較佳地包括以下步驟：
[0104] ①提取質粒標準分子；
[0105] ②用TE緩沖液使紫外分光光度計校正為零點；
[0106] ③取適量DNA(根據(jù)儀器的需要）至比色杯中（nanodrop直接點在檢測區(qū)域），記 錄儀器讀數(shù)。
[0107] ④若可直接讀出DNA濃度則直接記錄；若不可，則記錄樣品在260nm和280nm的光 密度，DNA樣品的濃度為0D260 X核酸稀釋倍數(shù)X 50,濃度單位為ng/ μ L。
[0108] (2) HR-ICP-MS對質粒標準分子定量方法較佳地包括以下步驟：
[0109] ①提取質粒標準分子；
[0110] ②根據(jù)質粒標準分子的堿基組成和序列長度，分別計算各質粒標準分子的磷元素 的含量；
[0111] ③配制梯度濃度的磷標準溶液，并用此標準溶液作出HR-ICP-MS的標準曲線。
[0112] ④HR-ICP-MS檢測質粒標準分子，并根據(jù)標準曲線得出質粒標準分子的磷含量。
[0113] ⑤根據(jù)質粒標準分子的磷含量計算出質粒標準分子的濃度。
[0114] 本發(fā)明還提供