番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5分子標記引物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及分子標記技術領域，具體涉及一種番茄黃化曲葉 病抗病基因 ty-5分子標記引物及其應用。
【背景技術】
[0002] 番前（Solanum Iycopersicum)是世界上重要的蔬菜作物，在促進農業(yè)經濟發(fā)展、 農民增收方面發(fā)揮著巨大的作用。種植過程中易受到多種病害的影響，導致產量下降，選育 抗病品種十分重要。
[0003] 番前黃化曲葉病（Tomato yellow leaf curl disease TYIXD)是番前的重要病 害，該病害是由雙生病毒科（Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus)的番前 黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus TYLCV)引起，主要通過煙粉虱（Bemisia tabaci)傳播。該病害最早報道于以色列，隨著國際貿易往來的深入，TYLCV逐漸向全球范 圍擴展，20世紀90年代，該病害傳入我國，目前已經遍布我國所有的番茄主產區(qū)，對番茄生 產造成嚴重危害，造成巨大的經濟損失。
[0004] TYLCV危害番茄后，通過農業(yè)防治、化學防治不僅效果差，甚至還會對生態(tài)環(huán)境造 成破壞，選育和種植抗病品種是最經濟、有效、環(huán)保的防治方法。由于TYLCV自身的變異，使 得只含有Ty-I和Ty-2的番茄材料在一些區(qū)域喪失了抗性，而目前國內市場的番茄品種中 均不含有ty-5基因，為了加快ty-5基因分子標記輔助育種（marker-assisted selection， MAS)的進程，開發(fā)與ty-5緊密連鎖的標記，選育含有ty-5基因的材料具有重要的意義。
[0005] 目前在ty-5連鎖標記研究方面，只確定1個CAPS標記SlNACl連鎖，連鎖距離尚不 明確；（參見Hutton SF，Sco1:t JW，Schuster DJ. Recessive Resistance to Tomato yellow leaf curl virus from the Tomato Cultivar Tyking Is Located in the Same Region as Ty_5on Chromosome 4. Hortscience，2012,47 (3) :324-327)，并且該標記類型在進行檢 測時，需要對PCR產物進行酶切，實驗成本高，操作繁瑣。

【發(fā)明內容】

[0006] 為了克服現有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種番茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記引物，用于篩選與TYLCV抗性基因 ty-5緊密連鎖的分子標記。
[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下：
[0008] 番茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記引物，該分子標記引物包括
[0009] 上游引物從 5 ' 端到 3 ' 端為：TAACAAAGCCCTCAAAGC ;
[0010] 下游引物 5' 端到 3' 端為：GTCTCCGAAACGTAATCC。
[0011] 本發(fā)明另一個目的在于提供了一種番茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記， 解決常規(guī)育種中，抗性鑒定工作量大、周期長、成本高的問題；
[0012] 番前黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記為InDel標記類型，是利用上述前黃化 曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記引物，經過PCR擴增得到的與ty-5緊密連鎖的共顯性DAN 分子標記，該分子標記的核苷酸序列為SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4所示。
[0013] 本發(fā)明的第三個目的在于提供一種番茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記分 子標記方法，克服ty-5標記需要酶切的缺陷，應用分子生物學方法，以含有ty-5基因番茄 自交系AVT01227為材料，篩選與TYLCV抗性基因 ty-5緊密連鎖的分子標記。
[0014] 番茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記方法，包括以下步驟：
[0015] 1)提取番茄基因組DNA ;
[0016] 2)以上述番前基因組DNA為模板與上述番前黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標 記引物進行PCR擴增，對PCR反應的產物進行分離、鑒定、顯色后，檢測判斷番茄黃化曲葉病 抗病基因 ty-5。
[0017] 進一步的，上述分子標記方法所述的步驟2)中，PCR反應體系為：IOng/ μ L 模板 DNA 1 μ L ;4pmmol/L 分子標記引 物 I. 0 μ L ;10XPCR Buffer I. 0 μ L ;25mmol/ L MgCl2I. 0 y L ； 10mmol/L dNTPsO. 25 μ L ；5U/μ L rTaq DNA PolymeraseO. I μ L ；ddH20 5. 65 μ L ;PCR反應擴增程序為：94°C預變性5min ;每個循環(huán)94°C變性30s，48°C退火30s， 72 °C延伸30，共38個循環(huán)，最后72 °C延伸7min。
[0018] 本發(fā)明的第四個目的在于提供番茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記引物在 番前黃化曲葉病毒病抗性基因 ty-5的檢測中和在ty-5基因的分子標記輔助育種中應用。
[0019] 番茄黃化曲葉病毒病抗性基因 ty-5檢測方法：以番茄基因組DNA為模板與上述番 茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記引物進行PCR擴增，對擴增產物進行聚丙烯酰胺凝 膠電泳，對電泳后條帶進行記錄，根據條帶大小確定是否含有ty-5基因；其中
[0020] PCR反應體系為：反應體系共10 μ L，IOng/ μ L模板DNA L 0 μ L ;4pmmol/L分子標 記引物 1.0 yUlOXPCR Buffer 1.0 μ L、25mmol/L MgCl2L 0 μ L、10mmol/L dNTPsO. 25 μ L、 5U/μ L rTaq DNA Polymerase 0· I μ L、ddH20 5· 65 μ L ;
[0021] PCR反應擴增程序為：94°C預變性5min ;每個循環(huán)94°C變性30s，48°C退火30s， 72 °C延伸30，共38個循環(huán)，最后72 °C延伸7min。
[0022] 相比現有技術，本發(fā)明的有益效果在于：
[0023] 1.本發(fā)明所述的分子標記引物能TYLCV抗性基因 ty-5緊密連鎖，可以用TYLCV抗 性基因 ty-5的篩選和檢測；
[0024] 2.本發(fā)明所述的分子標記是一種InDel標記，利用一種廣泛分布在作物基因組 上，根據堿基序列插入或缺失設計的標記，為共顯性標記，其在基因組上的分布廣泛，與 CAPS標記相比，不需要經過酶切就可以進行多態(tài)性的分析，操作方便、簡潔，實驗成本??；
[0025] 3.本發(fā)明通過開發(fā)與ty-5連鎖的InDel標記，在分離群體中篩選與ty-5緊密連 鎖的標記，以實現TYLCV分子標記輔助育種，加速對含有ty-5基因的番茄品種選育進程；
[0026] 4.本發(fā)明的分子標記可以與其他的連鎖標記結合，確定ty-5在染色體上的位置， 為該基因的精細定位和此后對該基因的克隆奠定了基礎；
[0027] 5.本發(fā)明的分子標記應用于對ty-5基因抗性材料的選育，可降低生產過程中化 學農藥的施用，減輕病害的傳播流行，節(jié)約生產成本，保障番茄生產的順利開展，提高番茄 產業(yè)的經濟效益。
【附圖說明】
[0028] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明；
[0029] 圖I InDel標記ty5_17在親本和極抗、極感單株的擴增圖譜；其中M :100bp Marker ;P1 :抗病親本 AVT01227 ;P2 :感病親本 moneymaker ; 1-5 :F2 極抗病單株；6-10 :F2 極感病單株；
[0030] 圖2 InDel標記ty5-17在親本和任意37株F2單株的擴增圖譜；其中 M : IOObp marker ;P1 :抗病親本 AVT01227 ;P2 :感病親本 moneymaker ;F2 單株；由 moneymakerXAVT01227的Fl自交獲得的任意37株F2單株；
[0031] 圖3 InDel標記ty5_17在不同番茄材料及品種組合中的擴增圖譜；其中，MdOObp marker ;P1 :抗病親本 AVT01227 ;P2 :感病親本 moneymaker ;1 :1106-7-0 ;2 :9210 ;3 :9320 ; 4 :FJ-1 ;5 :CLN2026D ;6 :CLN2777A ;7 :金陵美玉；8 :金陵寶玉 9 :蘇粉 11 號；10 :蘇粉 14 號； 11 ：moneymaker XAVT 01227 〇
【具體實施方式】
[0032] 番前黃化曲葉病抗病基因 ty_5的分子標記引物，該分子標記引物包括
[0033] 上游引物從 5' 端到 3' 端為：TAACAAAGCCCTCAAAGC(SEQ ID No. 1);
[0034] 下游引物 5' 端到 3' 端為：GTCTCCGAAACGTAATCC(SEQ ID No. 2)。
[0035] 具體的，番茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記引物為InDel標記類型，能與 ty-5基因緊密連鎖。
[0036] 本發(fā)明另一個目的在于提供了一種番前黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記， 解決常規(guī)育種中，抗性鑒定工作量大、周期長、成本高的問題；
[0037] 番茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記為InDel標記類型，是利用上述茄黃化 曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記引物，經過PCR擴增得到的與ty-5緊密連鎖的共顯性DAN 分子標記，該分子標記的核苷酸序列為SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4所示。
[0038] 本發(fā)明的第三個目的在于提供一種番茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記分 子標記方法，克服ty-5標記需要酶切的缺陷，應用分子生物學方法，以含有ty-5基因番茄 自交系AVT01227為材料，篩選與TYLCV抗性基因 ty-5緊密連鎖的分子標記。
[0039] 番茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記方法，包括以下步驟：
[0040] 1)提取番茄基因組DNA ;
[0041] 2)以上述番茄基因組DNA為模板與上述番茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標 記引物進行PCR擴增，對PCR反應的產物進行分離、鑒定、顯色后，檢測判斷番茄黃化曲葉病 抗病基因 ty-5。
[0042] 進一步的，上述分子標記方法所述的步驟2)中，PCR反應體系為：IOng/ μ L 模板 DNA 1 μ L ;4pmmol/L 分子標記引 物 1. 0 μ L ;10XPCR Buffer 1. 0 μ L ;25mmol/ L MgCl2I. 0 y L ； 10mmol/L dNTPsO. 25 μ L ；5U/μ L rTaq DNA PolymeraseO. I μ L ；ddH20 5. 65 μ L ;PCR反應擴增程序為：94°C預變性5min ;每個循環(huán)94°C變性30s，48°C退火30s， 72 °C延伸30，共38個循環(huán)，最后72 °C延伸7min。
[0043] 本發(fā)明的第四個目的在于提供番茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記引物在 番前黃化曲葉病毒病抗性基因 ty-5的檢測中和在ty-5基因的分子標記輔助育種中應用。
[0044] 番茄黃化曲葉病毒病抗性基因 ty-5檢測方法：以番茄基因組DNA為模板與上述番 茄黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記引物進行PCR擴增，對擴增產物進行聚丙烯酰胺凝 膠電泳，對電泳后條帶進行記錄，根據條帶大小確定是否含有ty-5基因；其中
[0045] PCR反應體系為：反應體系共10 μ L，IOng/ μ L模板DNA L 0 μ L ;4pmmol/L分子標 記引物 1.0 yUlOXPCR Buffer 1.0 μ L、25mmol/L MgCl2LO μ L、10mmol/L dNTPsO. 25 μ L、 5U/μ L rTaq DNA Polymerase 0· I μ L、ddH20 5· 65 μ L ;
[0046] PCR反應擴增程序為：94°C預變性5min ;每個循環(huán)94°C變性30s，48°C退火30s， 72 °C延伸30，共38個循環(huán)，最后72 °C延伸7min。
[0047] 以下是本發(fā)明具體的實施例，在下述實施例中除了給出說明的原料或試劑的來源 外，其他材料及試劑均為現有的材料和試劑，可以通過購買方式獲得；在下述實施例中本發(fā) 明所述的番前黃化曲葉病抗病基因 ty-5的分子標記引物簡稱為ty5_17。
[0048] 實施例1