一種高產(chǎn)揚(yáng)奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高產(chǎn)揚(yáng)奇青霉α -半乳糖苷酶的里氏木 霉菌株的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] α -半乳糖昔酶（a -D-galactoside galactohydrolase ;EC 3. 2. 1. 22)是一種外 切糖苷酶，能特異性水解糖鏈非還原末端的α-l，6-半乳糖苷鍵。它能夠催化含α-半乳 糖苷鍵的寡糖水解，如蜜二糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖等，同時(shí)還能夠催化含該鍵的雜多 糖水解，如α -半乳甘露聚糖等。已有研究表明，α-半乳糖苷酶在工業(yè)中有著巨大應(yīng)用 前景。比如飼料工業(yè)中，α-半乳糖苷酶能夠有效除去豆柏飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料 中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率；制糖工業(yè)中，α -半乳糖苷酶能夠提高蔗糖得率，降低制糖成本；造 紙業(yè)中，α -半乳糖苷酶能夠協(xié)同甘露聚糖酶的作用提高紙張的漂白效果；在醫(yī)療行業(yè)中， α -半乳糖苷酶在治療Fabry病和Schindler病以及血型改造方面都有著重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] α -半乳糖苷酶廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中，但與微生物相比，動(dòng)植物體內(nèi) 該酶的含量少且提取純化工藝復(fù)雜。目前α-半乳糖苷酶主要來(lái)源于黑曲霉及青霉，但利 用原菌株發(fā)酵的產(chǎn)量較低，成本較高。近年來(lái)利用基因工程技術(shù)克隆新的α-半乳糖苷酶 基因并在常用表達(dá)宿主中表達(dá)已成為主要研究趨勢(shì)，且酶的產(chǎn)量與原菌株相比有較大提高 (表1)。其中畢赤酵母中表達(dá)的α-半乳糖苷酶產(chǎn)量最高，酶活特異性好，但仍未達(dá)到工業(yè) 生產(chǎn)水平，發(fā)酵過(guò)程中需轉(zhuǎn)接且需要用大量的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，程序繁瑣，成本高，更為重要 的是巴斯德畢赤酵母不是FDA認(rèn)證的GRAS微生物，生物安全性存在隱患，不適用于食品醫(yī) 療中的應(yīng)用。因此，開發(fā)安全性高、發(fā)酵提純工藝簡(jiǎn)單、成本低的新的表達(dá)系統(tǒng)是十分必要 的。
[0004] 里氏木霉（Trichoderma reesei)是美國(guó)FDA認(rèn)證的安全生產(chǎn)菌株，蛋白表達(dá)分泌 能力強(qiáng)，某些突變株的胞外蛋白分泌量可達(dá)到l〇〇g/L，并且具有與高等哺乳動(dòng)物相似的糖 基化修飾系統(tǒng)，因此里氏木霉非常適合表達(dá)真核來(lái)源的藥用、食品級(jí)蛋白。
[0005] 表1、近期不同宿主表達(dá)α -半乳糖苷酶的相關(guān)研究


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組菌。
[0008] 本發(fā)明提供的重組菌，為如下1)或2):
[0009] 1)所示的重組菌是將揚(yáng)奇青霉α -半乳糖苷酶的編碼基因?qū)胨拗骼锸夏久咕?Trichoderma reesei，得到的菌；
[0010] 2)所示的重組菌是將揚(yáng)奇青霉α -半乳糖苷酶的編碼基因和篩選標(biāo)記基因?qū)?宿主里氏木霉菌Trichoderma reesei，得到的菌；
[0011] 所述揚(yáng)奇青霉α -半乳糖苷酶的氨基酸序列為序列3。
[0012] 上述重組菌中，所述揚(yáng)奇青霉α-半乳糖苷酶的編碼基因是通過(guò)表達(dá)揚(yáng)奇青霉 α-半乳糖苷酶的重組載體導(dǎo)入宿主里氏木霉菌；
[0013] 上述重組菌中，所述表達(dá)揚(yáng)奇青霉α -半乳糖苷酶的重組載體為 pSK-Pagl-Histag 重組載體；
[0014] 所述pSK-Pagl-Histag重組載體是將所述揚(yáng)奇青霉α -半乳糖苷酶的編碼基因插 入pSK-Pcbhl-sig-Tcbhl載體的多克隆位點(diǎn)得到的。
[0015] 上述重組菌中，所述篩選標(biāo)記基因?yàn)閜yr4基因。
[0016] 上述重組菌中，所述pyr4基因是通過(guò)pSK-pyr4重組載體導(dǎo)入宿主里氏木霉菌；
[0017] 所述pSK_pyr4重組載體是將pyr4基因插入pBluescript SK(+)載體的多克隆位 點(diǎn)得到的。
[0018] 上述重組菌中，所述揚(yáng)奇青霉α -半乳糖苷酶的編碼基因的核苷酸序列為序列1 ; 所述pyr4基因的核苷酸序列為序列2。
[0019] 上述重組菌中，所述里氏木霉菌為尿嘧啶缺陷型里氏木霉菌。
[0020] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述重組菌的新用途。
[0021] 本發(fā)明提供了上述重組菌在生產(chǎn)α -半乳糖苷酶中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明還提供了上述重組菌在提高α -半乳糖苷酶活力中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)揚(yáng)奇青霉α -半乳糖苷酶的方法。
[0024] 本發(fā)明提供的生產(chǎn)揚(yáng)奇青霉α -半乳糖苷酶的方法包括如下步驟：發(fā)酵培養(yǎng)上述 重組菌，得到所述揚(yáng)奇青霉α-半乳糖苷酶。
[0025] 上述方法中，所述培養(yǎng)的條件為30°C培養(yǎng)7天。
[0026] 上述方法中，所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為玉米漿工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基；所述玉米漿工業(yè)發(fā)酵 培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)在所述玉米漿工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度為玉米芯I. 5g/30ml ;麩皮0· 9g/30ml ;玉米漿L 5% (體積分?jǐn)?shù)）。
[0027] 本發(fā)明去除了揚(yáng)奇青霉α -半乳糖苷酶基因自身的信號(hào)肽序列，選用了里氏木霉 cbhl基因的啟動(dòng)子、信號(hào)肽及終止子來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體，將來(lái)自揚(yáng)奇青霉的α -半乳糖苷酶 基因定點(diǎn)整合到里氏木霉基因組中的高效表達(dá)位點(diǎn)一一cbhl基因位點(diǎn)，得到高產(chǎn)揚(yáng)奇青霉 α -半乳糖苷酶的里氏木霉菌株，利用里氏木霉cbhl強(qiáng)啟動(dòng)子及其信號(hào)肽序列在里氏木霉 中實(shí)現(xiàn)了揚(yáng)奇青霉α -半乳糖苷酶的高效分泌表達(dá)。通過(guò)試驗(yàn)證明：對(duì)高產(chǎn)揚(yáng)奇青霉α -半 乳糖苷酶的里氏木霉菌株進(jìn)行發(fā)酵獲得的發(fā)酵液的酶活力單位可達(dá)到119. 16U/ml。本發(fā)明 的發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，只需將孢子液接種至玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)基中即可，不需轉(zhuǎn)接，且本發(fā)明的原 料廉價(jià)易得，大大降低成本，非常適合工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為里氏木霉α -半乳糖苷酶表達(dá)菌株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果。圖IA為 里氏木霉α-半乳糖苷酶陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證示意圖；圖IB為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證 核酸電泳圖。其中，1-4泳道為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR結(jié)果，5-8泳道為Λ tku70菌株的PCR結(jié) 果，1、5為Pagl orf片段驗(yàn)證，2、6為Pagl up片段驗(yàn)證，3、7為Pagl down片段驗(yàn)證，4、8 為cbh Iorf片段驗(yàn)證。
[0029] 圖2為里氏木霉α -半乳糖苷酶表達(dá)菌株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的SDS-PAGE鑒定。其中， 1為對(duì)照菌株Λ tku70菌株的發(fā)酵168h結(jié)果，2-7為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子pagl6發(fā)酵48h、72h、96h、 120h、144h、168h 結(jié)果。
[0030] 圖3為里氏木霉重組表達(dá)純化的α半乳糖苷酶的SDS-PAGE鑒定。其中，1為純化 前樣品，2為純化穿透，3和4為純化后樣品。
[0031] 圖4為里氏木霉重組表達(dá)的α半乳糖苷酶最適溫度。
[0032] 圖5為里氏木霉重組表達(dá)的α半乳糖苷酶溫度穩(wěn)定性。
[0033] 圖6為里氏木霉重組表達(dá)的α半乳糖苷酶最適pH。
[0034] 圖7為里氏木霉重組表達(dá)的α半乳糖苷酶pH穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0036] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0037] 下述實(shí)施例中的里氏木霉Λ tku70菌株為尿嘧啶缺陷型菌株，作為α-半乳糖 苷酶的表達(dá)宿主，在文獻(xiàn) "Zhang Guangtao, Lukas Hartl, Andre Schuster, et al. Gene targeting in a nonhomologous end joining deficient Hypocrea jecorina. Journal of Biotechnology, 2009, 139:146-151"中公開過(guò)，公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得。
[0038] 下述實(shí)施例中的pBluescript SK (+)購(gòu)買自Stratagene公司，產(chǎn)品目錄號(hào) VKS0288。
[0039] 下述實(shí)施例中的MM培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其在MM培養(yǎng)基中 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：(NH4)2SO4 0· 5% !KH2PO4 I. 5% ;MgS04 0· 06% ;CaCl2 0· 06% ;FeS04 · 7H20 0· 0005% ;MnS04·H2O 0.00016% ;ZnS04.7H20 0.00014% ;CoC12 0.0002% ;調(diào) ρΗ5· 3,115°C 高壓蒸汽滅菌。
[0040] 下述實(shí)施例中的LB培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其在LB培養(yǎng)基中 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：蛋白胨1% ;氯化鈉1% ;酵母提取物〇. 5%，自然pH，121°C高壓蒸汽滅菌。
[0041] 下述實(shí)施例中的pNPG溶液（15mM)的制備方法：準(zhǔn)確稱取0. 45189g pNPG (對(duì)硝基 苯a -D-吡喃半乳糖苷），溶解到蒸餾水中定容至100ml。
[0042] 下述實(shí)施例中的IOO