微生物能力驗證沙門氏菌樣品的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物能力驗證技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及微生物能力驗證沙門氏菌樣品的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]能力驗證是實驗室外部質(zhì)量控制的有效措施之一，也是計量從證和實驗室認(rèn)可的必備條件。實施微生物能力驗證能夠有效評估參與實驗室進(jìn)行相關(guān)微生物檢驗的技術(shù)能力。
[0003]沙門氏菌作為近年我國食品中毒和食源性疾病常見的病原菌，是能力驗證項目常選用的目標(biāo)菌。但是目前，微生物學(xué)檢驗領(lǐng)域尚無高可信度、高通量的微生物能力驗證制備技術(shù)，不確定因素較多，使得實驗室間能力驗證的可信度大打折扣。
[0004]曹文博等在《食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報》的2015年第6卷第I期公開了一種沙門氏菌能力驗證樣品的制備方法:采用真空冷凍干燥的方式制備樣品，該方法在一定程度上提高了樣品的穩(wěn)定性和均勻性，但是仍然不夠理想，且缺乏難度等級對比標(biāo)準(zhǔn)。
[0005]現(xiàn)有的微生物能力驗證沙門氏菌樣品，樣品的菌種穩(wěn)定性較差，菌種的存活率也較低，且不同種類樣品的驗證難度不一，缺乏對比標(biāo)準(zhǔn)，因而使得微生物能力驗證的意義也大打折扣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種微生物能力驗證沙門氏菌樣品的制備方法，該方法制備的樣品穩(wěn)定性好，菌種存活率高，具有合理的不同難度等級標(biāo)準(zhǔn)。
[0007]本發(fā)明的具體技術(shù)方案為:微生物能力驗證沙門氏菌樣品的制備方法，以沙門氏菌為目標(biāo)菌，以粘質(zhì)沙雷氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌為干擾菌，包括如下步驟:
(A)、菌株的復(fù)蘇、增菌:將目標(biāo)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌和各干擾菌的標(biāo)準(zhǔn)菌分別加入到營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在36土 1°C下使所述各標(biāo)準(zhǔn)菌復(fù)蘇、生長和增菌，培養(yǎng)期間并對各菌株進(jìn)行菌種鑒定。
[0008](B)、菌株的分離:當(dāng)上述培養(yǎng)的沙門氏菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期時對其培養(yǎng)基進(jìn)行離心分離，得到沙門氏菌菌泥；當(dāng)每一種干擾菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，對其培養(yǎng)基進(jìn)行離心分離，得到各干擾菌菌泥。
[0009](C)、菌懸液的制備:
簡單級陰性樣品菌懸液的制備:將I份大腸桿菌菌泥添加到濃度為8-12被％的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液的濃度為(3-7) X 104cfu/mL，攪拌均勻后得到簡單級陰性樣品菌懸液。
[0010]簡單級陽性樣品菌懸液的制備:將I份沙門氏菌菌泥和I份大腸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt%的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3-7) X 102cfu/mL,各干擾菌的濃度為(3-7) X104cfu/mL，攪拌均勻后得到簡單級陽性樣品菌懸液。
[0011]中級陰性樣品菌懸液的制備:將I份大腸桿菌菌泥和I份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt%的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3-7) X 12Cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3-7) X104cfu/mL，攪拌均勻后得到中級陰性樣品菌懸液。
[0012]中級陽性樣品菌懸液的制備:將I份沙門氏菌菌泥和I份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt%的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3-7) X 12Cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3-7) X104cfu/mL，攪拌均勻后得到中級陽性樣品菌懸液。
[0013]困難級陰性樣品菌懸液的制備:將I份大腸桿菌菌泥、I份粘質(zhì)沙雷氏菌菌泥和I份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt%的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3-7) X102cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3_7) X 104cfu/mL，攪拌均勻后得到困難級陰性樣品菌懸液。
[0014]困難級陽性樣品菌懸液的制備:將I份沙門氏菌菌泥、I份大腸桿菌菌泥、I份粘質(zhì)沙雷氏菌菌泥和I份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt%的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3-7) X102cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3_7) X 104cfu/mL，攪拌均勻后得到困難級陽性樣品菌懸液。
[0015]上述份數(shù)均為重量份數(shù)；
(D)、冷凍干燥和包裝:分別稱取上述制備的每種菌懸液lmL，并分別添加到各自的安瓶中，將所述安瓶平開蓋放入冷凍干燥機(jī)中，在_22°C至-18°C溫度下預(yù)先凍結(jié)7-9h，接著轉(zhuǎn)移到溫度為-50°C至-40°C的冷凍干燥機(jī)中，抽真空并使真空度達(dá)到10Hg以上，然后將安瓶均勻放置于冷凍室內(nèi)的隔板上，升華干燥45-55h ;待安瓶內(nèi)物質(zhì)呈乳白色疏松海綿狀時，對安瓶繼續(xù)進(jìn)行解析干燥1.5-2.5h ;結(jié)束后對安瓶進(jìn)行封口、壓蓋、貼簽，制得微生物能力驗證沙門氏菌樣品，將所述樣品貯存于4°C的環(huán)境中。
[0016]本發(fā)明選用沙門氏菌為目標(biāo)菌，選用粘質(zhì)沙雷氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌為干擾菌，并且根據(jù)干擾菌與沙門氏菌檢測時的相似程度，制備成三個難度等級樣品組，每個樣品組包括陽性樣品和陰性樣品。按本發(fā)明方法制備的樣品，通過控制制備過程中的各項參數(shù)，使得樣品中菌種的穩(wěn)定性和存活率較高。
[0017]作為優(yōu)選，所述步驟(A)中各菌株的培養(yǎng)基中添加有海藻糖，所述海藻糖在培養(yǎng)基中的含量為2-4g/mL。在培養(yǎng)基中添加海藻糖的目的是，菌類在將海藻糖作為碳源進(jìn)行吸收后，海藻糖能夠進(jìn)行菌類的細(xì)胞膜內(nèi)部，當(dāng)進(jìn)行后續(xù)的冷凍干燥過程時，海藻糖的存在能夠提高菌類的抗凍能力，使得細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞液不易形成冰晶，避免了由于細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞液變成冰晶，升高了細(xì)胞的滲透壓而導(dǎo)致菌類死亡的情況。
[0018]作為優(yōu)選，在所述步驟(B)中對培養(yǎng)有菌株的各個培養(yǎng)基進(jìn)行分離前，將所述培養(yǎng)基放置于45-50°C的環(huán)境中l(wèi)_2h。在進(jìn)行分離前對培養(yǎng)基進(jìn)行上述步驟，有利于菌株對培養(yǎng)基中海藻糖的吸收，有利于海藻糖進(jìn)入菌株細(xì)胞內(nèi)部。
[0019]作為優(yōu)選，在所述步驟(C)配制各菌懸液時，所述脫脂牛乳水溶液中還添加有殼聚糖和聚乙烯醇中的一種或多種。殼聚糖或聚乙烯醇的存在，在對菌懸液進(jìn)行冷凍干燥時，作為對冷凍保護(hù)劑脫脂牛乳的補(bǔ)充，殼聚糖或聚乙烯醇在冷凍干燥過程中成為凝膠，具有眾多的三維孔道結(jié)構(gòu)，能夠?qū)赀M(jìn)行一定程度的包埋和吸附，形成了一個緩沖保護(hù)層，起到了一個隔離作用，在一定程度上削弱了極低溫度對菌株的影響。此外殼聚糖和聚乙烯醇可被菌類自然分解，對菌類無害。
[0020]作為優(yōu)選，所述殼聚糖或聚乙烯醇在所述脫脂牛乳水溶液中的濃度均為0.2—0.5wt % ο
[0021]作為優(yōu)選，所述聚乙稀醇的相對分子量為16000-20000。在此分子量范圍的聚乙稀醇黏度較低，適合作為保護(hù)劑。
[0022]作為優(yōu)選，在所述步驟(D)中對所述安瓶進(jìn)行封口和壓蓋時在冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)操作，且封口后安瓶內(nèi)為真空狀態(tài)。
[0023]作為優(yōu)選，在所述步驟(A)中對各標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)時，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌株，并將其接種到1mL的培養(yǎng)基中。
[0024]作為優(yōu)選，在所述步驟(B)中配制各菌懸液時，所述脫脂牛乳水溶液的濃度為1wt %，菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為5 X 102cfu/mL，各干擾菌的濃度為5 X 104cfu/mL。
[0025]作為優(yōu)選，在所述步驟(D)中，安瓶在的預(yù)先凍結(jié)溫度為_20°C，預(yù)先凍結(jié)8h ;接著轉(zhuǎn)移到的冷凍干燥機(jī)的溫度為_45°C ;對安瓶的升華干燥時間為50h ;對安瓶的解析干燥時間為2ho
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明方法制備的樣品穩(wěn)定性好，菌種存活率高，且具有合理的不同難度等級標(biāo)準(zhǔn)。
【附圖說明】
圖1是保存溫度以及保存時間對實施例2中簡單級陽性樣品穩(wěn)定性的影響。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0028]實施例1
微生物能力驗證沙門氏菌樣品的制備方法，以沙門氏菌為目標(biāo)菌，以粘質(zhì)沙雷氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌為干擾菌，包括如下步驟:
(A)、菌株的復(fù)蘇、增菌:用接種環(huán)挑取一環(huán)各菌株，將目標(biāo)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌和各干擾菌的標(biāo)準(zhǔn)菌分別加入到1mL的營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在36± I°C下使所述各標(biāo)準(zhǔn)菌復(fù)蘇、生長和增菌，培養(yǎng)期間并對各菌株進(jìn)行菌種鑒定。
[0029](B)、菌株的分離:當(dāng)上述培養(yǎng)的沙門氏