一種文心蘭無(wú)毒種苗生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬植物栽培技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種種苗的生產(chǎn)方法，具體是一種文心蘭無(wú)毒 種苗生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 文心蘭是文心蘭屬（Oncidium)植物總稱(chēng)，其花姿優(yōu)美、分枝性高、花朵數(shù)多、花色 亮麗搶眼，甚具喜氣，是獨(dú)具優(yōu)勢(shì)的鮮切花品種，在西洋插花或是節(jié)慶活動(dòng)上常廣泛地應(yīng) 用，市場(chǎng)潛力巨大。
[0003] 世界栽培的文心蘭切花品種以南茜（OncidiumGowerRamsey)及其變異品種仍為 文心蘭主栽品種，由于品種間雜交不育和自交不親和，生產(chǎn)上所需的種苗主要通過(guò)組培快 繁技術(shù)進(jìn)行培育。組織培養(yǎng)技術(shù)在克隆親本植物性狀同時(shí)，也復(fù)制其親本單株所感染的病 毒病。病毒病是文心蘭生產(chǎn)上重要病害，可感染蘭花病毒種類(lèi)至少有20多種，蘭花病毒廣 泛分布于全世界各個(gè)蘭園，其中最常見(jiàn)的和經(jīng)濟(jì)意義最大的要數(shù)建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaicvirus,CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒（Odontolossumringspotvirus, 0RSV)DCymMV在 葉片和花瓣上造成變色和向下凹陷的壞死斑塊，花朵受害形成畸形和花色條斑。0RSV在葉 片上形成條狀或線狀花葉，或形成菱形或環(huán)形的斑點(diǎn)，有時(shí)在花瓣上也能見(jiàn)到花斑或環(huán)斑。 且這兩種病毒通常在文心蘭上復(fù)合感染，復(fù)合感染這兩種病毒的花朵能產(chǎn)生棕色的壞死條 斑，造成更為嚴(yán)重的危害。
[0004] 文心蘭生產(chǎn)上使用攜帶CymMV和0RSV病毒的種苗極為普遍，嚴(yán)重影響后續(xù)的生 長(zhǎng)發(fā)育、開(kāi)花品質(zhì)和鮮切花產(chǎn)量。文心蘭感染病毒初期并不表現(xiàn)明顯癥狀，容易被栽培者 疏忽，外表健康的植株很難確定是否攜帶病毒，而一旦母株感染了病毒，所有后代就都會(huì)帶 毒，而且地區(qū)間頻繁地引種與品種交流也增加了病毒傳播的機(jī)會(huì)。感染病毒的植株通常都 能長(zhǎng)出看起來(lái)很健康的新葉，但開(kāi)出的花卻表現(xiàn)出壞死斑等影響市場(chǎng)價(jià)值的癥狀。為解決 文心蘭工廠化育苗過(guò)程中種苗帶毒率高的問(wèn)題，篩選出未感染病毒的母本植株對(duì)于生產(chǎn)高 質(zhì)量無(wú)毒種苗，以滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)外鮮切花和種苗市場(chǎng)的需要是非常重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種文心蘭無(wú)毒種苗生產(chǎn)方法，解決 了文心蘭無(wú)毒種苗工廠化生產(chǎn)的技術(shù)難題，為改善文心蘭的健康狀況，提高文心蘭的生長(zhǎng) 速度，增強(qiáng)文心蘭的生長(zhǎng)勢(shì)提供了技術(shù)支撐，有效推動(dòng)我國(guó)無(wú)毒種苗生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn) 經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益三者有機(jī)結(jié)合。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案：
[0007] -種文心蘭無(wú)毒種苗生產(chǎn)方法，其具體步驟如下：
[0008] 1、無(wú)病毒母本園的建設(shè)與管理
[0009] 建設(shè)具有遮雨、防蟲(chóng)、遮陽(yáng)、控溫控濕的母本園，溫度控制在25~30°C。冬季的陽(yáng) 光直射，夏季遮光率60~70 %，其他季節(jié)遮光率40 %。
[0010] 從大田采集優(yōu)良性狀或變異單株或引進(jìn)的目標(biāo)母本，經(jīng)檢測(cè)確定不帶有CymMV和 0RSV二種病毒后作為繁殖母株保存于母本園中，管理過(guò)程中采取隔離、消毒措施，避免目標(biāo) 母本被病毒感染。
[0011] 2、文心蘭病毒檢測(cè)
[0012] 從田間收集或引種具有優(yōu)良性狀的繁殖母株樣品，采用雙抗體夾心法 (DAS-ELISA)檢測(cè)CymMV和0RSV。選取有病毒感染癥狀植株的具有明顯癥狀葉片，或無(wú)病 毒感染癥狀植株的完全展開(kāi)的淡綠期葉片，樣品采集時(shí)，用滅菌的手術(shù)剪剪取葉片1片置 于封口袋中-20°C保存，最多存放7d。每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)重復(fù)。兩種病毒的檢測(cè)結(jié)果均為 陰性的樣品進(jìn)入母本園，任一病毒檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性均不能入園。組培快繁前用同樣的方 法對(duì)所用母本植株進(jìn)行CymMV和0RSV檢測(cè)，兩種病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性的植株方能進(jìn)行 組培操作，任一病毒檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性均應(yīng)淘汰并移出母本園。
[0013] 采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)組培母瓶的帶毒情況。兩種 病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性的組培瓶進(jìn)入下一步擴(kuò)繁操作，任一病毒檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性均淘 汰。
[0014] 3、花梗芽組培快繁
[0015] 在母本園中選取花梗清洗后消毒，選擇帶有休眠芽的花梗，以休眠芽為中心點(diǎn)上 下各2. 0~2. 5cm處切成長(zhǎng)4. 0~5. 0cm的小段，剝?nèi)バ菝哐可系能髌?，露出花芽，消毒?晾干備用。
[0016] 將帶有休眠芽的花梗小段放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)35~40d后把已經(jīng) 轉(zhuǎn)化成營(yíng)養(yǎng)芽的小段轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)（沒(méi)有轉(zhuǎn)化成營(yíng)養(yǎng)芽的小段重新切 段轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)，以35~40d為一個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期，轉(zhuǎn)接3次后約95%的休 眠芽轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)芽，把經(jīng)過(guò)三次誘導(dǎo)所獲得的營(yíng)養(yǎng)芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)）。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA2.Omg?L\TDZ1.Omg?L\NAA0? 2mg?L\ 卡拉膠 8.Og?L\蔗糖25g?L\pH為5. 6。所述繼代培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA 3.Omg?L\NAA0? 3mg?L\ 挪子水100mL?L\卡拉膠8. 0g?L\ 鹿糖25g?L\pH為5. 6。
[0017] 繼代增殖培養(yǎng)過(guò)程中，增殖培養(yǎng)初期20~25d為一個(gè)轉(zhuǎn)接周期，由于原球莖生長(zhǎng) 對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消耗量較大，較短的轉(zhuǎn)接周期利于原球莖保持最好的增殖生長(zhǎng)狀態(tài)，待原球莖增 殖生成后40~45d為一個(gè)循環(huán)周期繼代轉(zhuǎn)接一次，直至叢生芽生成。
[0018] 將繼代增殖所獲得的叢生芽轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，50~60d為一個(gè)周 期轉(zhuǎn)接一次，待小苗株高達(dá)到3. 0cm以上時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，株高在3. 0cm以下的 小苗繼續(xù)進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。所述壯苗培養(yǎng)是以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加香蕉漿50g?L\卡 拉膠 8. 0g?L\鹿糖 25g?L\pH為 5. 6。
[0019] 經(jīng)壯苗培養(yǎng)株高達(dá)到3. 0cm以上、有5~6片葉的小苗切分成獨(dú)立的植株，轉(zhuǎn)入生 根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)；經(jīng)生根培養(yǎng)60d后，待小苗長(zhǎng)出7~9片葉，3~6條根時(shí)即可移出 培養(yǎng)室進(jìn)行煉苗移栽。所述生根培養(yǎng)基是以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加NAA0. 5mg?L\ 香蕉衆(zhòng)50g?L\卡拉膠8. 0g?L\鹿糖25g?L\pH為5. 6。
[0020] 上述培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為23~27°C，光照強(qiáng)度2000~2500LUX;每 天光照時(shí)間為10~12小時(shí)。
[0021] 所述香蕉漿是取香蕉果肉打成漿狀。
[0022] 本發(fā)明所具有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
[0023] 本發(fā)明簡(jiǎn)單高效、經(jīng)濟(jì)適用、易于操作，徹底解決了文心蘭無(wú)毒種苗工廠化生產(chǎn)的 技術(shù)難題，為改善文心蘭的健康狀況，提高文心蘭的生長(zhǎng)速度，增強(qiáng)文心蘭的生長(zhǎng)勢(shì)提供了 技術(shù)支撐，為文心蘭種苗的企業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)保障，有效推動(dòng)我國(guó)無(wú)毒種苗生產(chǎn)技術(shù)的 發(fā)展，實(shí)現(xiàn)降低成本、提高產(chǎn)量、增加收入的目標(biāo)，從而實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益三者有機(jī) 結(jié)合。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1是各種文心蘭種苗的生長(zhǎng)情況對(duì)比。
[0025] A:本發(fā)明生產(chǎn)的無(wú)毒種苗；B:攜帶CymMV的種苗；C:攜帶0RSV的種苗；D:CymMV 和0RSV復(fù)合感染的種苗。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于 說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通 常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0027] 實(shí)施例
[0028] 1、選取具有遮雨、防蟲(chóng)（防蟲(chóng)網(wǎng)為100目）、移動(dòng)式遮陽(yáng)網(wǎng)和水簾風(fēng)機(jī)或空調(diào)、噴灌 設(shè)施等調(diào)節(jié)溫濕度的隔離環(huán)境作為母本園。溫度控制在25~30°C。冬季的陽(yáng)光直射，夏季 遮光率60~70 %，春秋季遮光率40 % ;
[0029]S1:母本入園前，采用雙抗體夾心法（DAS-ELISA)按照Liuetal.(2013)的方法 檢測(cè)CymMV和0RSV。每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)重復(fù)。讀取405nm的吸收值，參照Satula等（1986) 的方法，吸收值在陰性對(duì)照的2倍以上視為陽(yáng)性。兩種病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性的樣品進(jìn) 入母本園待用，任一病毒檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性均不得進(jìn)入母本園；
[0030] S2 :對(duì)進(jìn)入母本園內(nèi)的所有無(wú)病毒繁殖母株進(jìn)行獨(dú)立編號(hào)，植株間不得相互接觸。 栽培期間若發(fā)現(xiàn)可疑植株應(yīng)立即按S1的方法進(jìn)行病毒檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性者，為絕對(duì)避 免碰觸其他植株，立即用報(bào)紙等包裹后移出母本園，原置放位置進(jìn)行消毒處理。母本園每半 年按S1的方法例行一次病毒檢測(cè)；
[0031] S3 :母本園中所需的器材和工具等的使用前以及場(chǎng)地表面均應(yīng)進(jìn)行消毒處理。器 材和工具等的消毒，根據(jù)實(shí)際情況，可采取如下四種消毒方法之一。一是干熱消毒法，利用 烘箱在180°C至少維持2. 5小時(shí)；二是濕熱消毒法，以沸水煮沸至少15分鐘；三是火焰消毒 法，將工具上接觸過(guò)植物汁液的部位以火焰燒烤至少10秒。四是化學(xué)藥品消毒法，以3%氫 氧化鈉或磷酸三鈉溶液浸漬至少1分鐘。場(chǎng)地外表面消毒，先用清水洗滌干凈，再以〇. 5%