一種高效快速繁殖三葉青試管苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物的栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效快速繁殖三葉青試管苗的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 三葉青，學(xué)名：三葉崖爬藤（TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg)，又名金 線吊萌蘆、蛇附子、石老鼠，屬鼠李目，葡萄科，崖爬藤屬草質(zhì)藤本。為我國(guó)特有藥用植物，廣 泛分布于長(zhǎng)江以南各省份，主要有浙江、江西、福建、湖南、湖北、廣東、廣西、貴州、重慶、四 川、西藏、云南、海南和臺(tái)灣等地區(qū)，常生于山坡林下的灌叢中或山谷溪邊林下的巖石縫中， 生長(zhǎng)海拔300~1300m
[0003] 三葉青全草均可入藥，以地下塊根和果實(shí)的藥用效果最好。其性平、味微苦，具有 清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛等功效，主治毒蛇咬傷、扁桃體炎、淋巴結(jié)結(jié)核、跌打損傷、小 兒高熱驚厥等疾病。目前臨床上還應(yīng)用于抗癌、抗艾滋病毒，治療血液病、心腦血管疾病、 肝炎、病毒性腦膜炎等疾病。
[0004] 目前三葉青主要依賴(lài)于野生挖掘，近年來(lái)，由于過(guò)度采挖和生境破壞，致使鐵三葉 青野生資源已瀕臨滅絕，人工栽培已刻不容緩，但人工栽培存在種苗供應(yīng)不足，通過(guò)組培的 方法快速繁殖種苗有很大的市場(chǎng)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種高效快速繁殖三葉青試管苗的方法，以解決 現(xiàn)有技術(shù)存在的栽培效率不高的問(wèn)題。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種高效快速繁殖三葉青試管苗的方法，它包括如下步驟：
[0008] (1)選取三葉青的枝條，去除葉片后剪成5~10cm的莖段，用去污劑清洗lOmin 后，再用流水沖洗lOmin;將剪切沖洗后的三葉青莖段于體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇水溶液中 浸泡30~60s，再于氯化萊水溶液中浸泡5~8min;最后用無(wú)菌水沖洗3~5次后備用；
[0009] (2)將經(jīng)步驟（1)處理后的三葉青莖段剪成帶1~2個(gè)腋芽的小段，接種于固體培 養(yǎng)基中；培養(yǎng)40~50天后腋芽萌發(fā)，摘取芽長(zhǎng)1~2cm的腋芽備用；
[0010] (3)將步驟⑵中所得的腋芽置于增殖繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)50~60d;培養(yǎng)完成后， 三葉青腋芽生長(zhǎng)成無(wú)根小苗且在莖節(jié)處產(chǎn)生腋芽；
[0011] (4)將步驟（3)中所得三葉青無(wú)根小苗剪成帶1個(gè)腋芽的小段（或腋芽）并移至 壯苗生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)50~60天，得到三葉青成苗；
[0012] (5)選取步驟⑷中得到的4~5cm高，有2~3條根的三葉青成苗移到溫室中， 馴化培養(yǎng)10~15天后，用水沖洗去除培養(yǎng)基后，將三葉青成苗移栽到鋪有營(yíng)養(yǎng)土的苗床 上，并遮陰保濕；待三葉青成苗的苗高達(dá)到15cm后，即可進(jìn)行大田移栽。
[0013] 其中，為了繁殖出足夠多的可以進(jìn)行步驟（4)中操作的三葉青無(wú)根小苗，可選取 步驟（3)中所得的側(cè)芽長(zhǎng)度大于lcm的三葉青無(wú)根小苗重新剪成帶1個(gè)腋芽的小段（或腋 芽）接種于新的增殖繼代培養(yǎng)基中，重復(fù)步驟（3)中的培養(yǎng)過(guò)程。每轉(zhuǎn)接1次，增殖系數(shù)達(dá) 3~4。當(dāng)繁殖出足夠數(shù)量的小苗時(shí)，將所得的三葉青無(wú)根小苗進(jìn)行步驟（4)中操作。
[0014] 其中，對(duì)于上述步驟中是選擇帶腋芽的小段還是腋芽接種于新的增殖繼代培養(yǎng)基 中，重復(fù)步驟（3)中的培養(yǎng)過(guò)程，根據(jù)三葉青無(wú)根小苗的實(shí)際生長(zhǎng)情況而定。若無(wú)根小苗的 基部腋芽較長(zhǎng)，則剪取腋芽，若頂部腋芽較短，則剪取帶1個(gè)腋芽的小段
[0015] 步驟（1)中，所述的三葉青枝條為當(dāng)年生半木質(zhì)化莖段。
[0016] 步驟（1)中，所述的去污劑為家用洗衣粉。
[0017] 步驟⑴中，所述的氯化汞水溶液中，氯化汞的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1%~0. 15%。
[0018] 步驟（2)中，培養(yǎng)條件為22~25°C，光照強(qiáng)度為300~1000勒克斯，光照時(shí)間為 11~13h/d;其中，所述的固體培養(yǎng)基的配方包括：6_芐氨基嘌呤0~1. 0mg/L+蔗糖25~ 30g/L+ 瓊脂 4. 5 ~6g/L+ 土豆汁 60 ~80g/L+ 活性炭 0? 5g/L+MS培養(yǎng)基+pH5. 6 ~5. 8 ; 其中，固體培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為6-芐氨基嘌呤1. 0mg/L+蔗糖30g/L+MS培養(yǎng)基+瓊脂6g/ L+ 土豆汁 60g/L+ 活性炭 0? 5g/L+pH5. 8。
[0019] 步驟（3)中，培養(yǎng)條件為25~28°C，光照強(qiáng)度為1000~2000勒克斯，光照時(shí)間為 11~13h/d;其中，所述的增殖繼代培養(yǎng)基的配方包括：6_芐氨基嘌呤0~1. 0mg/L+萘乙酸 0 ~0? 5mg/L+ 土汁 60 ~80g/L+ 鹿糖 25 ~30g/L+ 瓊脂 4. 5 ~6g/L+ 活性炭 0? 5g/L+MS 培養(yǎng)基+PH5. 6~5. 8 ;其中，增殖繼代培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為6-芐氨基嘌呤1. 0mg/L+萘乙 酸 0? 5mg/L+ 土豆汁 60g/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L+ 活性炭 0? 5g/L+MS培養(yǎng)基+pH5. 8。
[0020] 步驟（4)中，培養(yǎng)條件為25~28°C，光照強(qiáng)度為1000~2000勒克斯，光照時(shí)間為 11~13h/d;其中，所述的壯苗生根培養(yǎng)基的配方包括：萘乙酸0. 2~0. 5mg/L+蔗糖25~ 30g/L+香蕉汁60~80g/L+瓊脂4. 5~6g/L+活性炭0? 5g/L+White培養(yǎng)基+pH5. 6~ 5. 8 ;其中，壯苗生根培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為萘乙酸0. 2mg/L+蔗糖30g/L+香蕉汁60g/L+瓊脂 6g/L+ 活性炭 0. 5g/L+White培養(yǎng)基+pH5. 8。
[0021] 步驟（5)中，溫室內(nèi)溫度為28~33°C，光照強(qiáng)度為6000~8000勒克斯。
[0022] 步驟（5)中，所述的營(yíng)養(yǎng)土由泥碳土和蛭石以3 :1的體積比混合而成。
[0023] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0024] 1、本發(fā)明可直接用于工廠化規(guī)?；姆N苗生產(chǎn)，具有污染少，增殖速度快，變異率 低，種苗整齊健壯，生產(chǎn)成本低，移栽成活率高等優(yōu)勢(shì)。
[0025] 2、三葉青的莖段消毒后，剪成帶1~2個(gè)腋芽的小段接種到步驟（2)中的固體培 養(yǎng)基中，采用MS并配以適當(dāng)?shù)募に?，與現(xiàn)有的三葉青腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基相比，該方法腋芽萌 發(fā)并長(zhǎng)到1~2cm的時(shí)間縮短10~15d，并且萌芽率高達(dá)80%以上，變異率小于1%，出芽 整齊。
[0026] 3、步驟（3)所述的繼代增殖培養(yǎng)基中，采用MS并配以適當(dāng)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素， 與傳統(tǒng)的繼代增殖培養(yǎng)基相比，該方法能更好更快的促進(jìn)小苗生長(zhǎng)和分枝，增殖系數(shù)可達(dá) 到3~4。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] (1)剪取三葉青的莖段，去除葉片，剪成10cm左右的小段，用家用洗衣粉清洗 lOmin，再用流水沖洗lOmin，將清洗干凈的枝條帶入超凈工作臺(tái)，75%體積分?jǐn)?shù)的酒精浸泡 45s，再放置于氯化萊水溶液中浸泡6min;無(wú)菌水沖洗3~5次。
[0030] (2)將步驟⑴得到的三葉青的無(wú)菌莖段剪成帶1~2個(gè)腋芽的小段接種于固體 培養(yǎng)基中，在22~25°C、光照度700勒克斯左右，光照時(shí)間12h/d的條件下，培養(yǎng)45d左右， 腋芽萌發(fā)，當(dāng)芽長(zhǎng)至1~2cm時(shí)，取腋芽備用；其中，所述的固體培養(yǎng)基組成為：6_芐氨基嘌 呤 1.Omg/L+ 鹿糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L+ 土豆汁 60g/L+ 活性炭 0? 5g/L+MS培養(yǎng)基+pH5. 8。
[0031] (3)將步驟（2)得到的腋芽置于增殖繼代培養(yǎng)基中，在25~28°C、光照度1500勒 克斯左右、光照時(shí)間12h/d的條件下培養(yǎng)50~60d，三葉青腋芽生長(zhǎng)無(wú)根小苗并在莖節(jié)處產(chǎn) 生側(cè)芽，等側(cè)芽長(zhǎng)至lcm長(zhǎng)時(shí)，將小苗重新剪成帶1個(gè)腋芽的小段重新接種到新的增殖培養(yǎng) 基，繼續(xù)培養(yǎng)，每轉(zhuǎn)接一次，增殖系數(shù)達(dá)3