專利名稱：:重組甲胎蛋白，其制備方法及手段，以其為基礎(chǔ)的組合物及其用途的制作方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及微生物和醫(yī)藥行業(yè)、遺傳工程學(xué)、生物工藝學(xué)。根據(jù)本發(fā)明的重組甲胎蛋白(AFP)保留了從血清獲得的人AFP的活性，希望用于腫瘤學(xué)、免疫治療、美容學(xué)。發(fā)明背景甲胎蛋白(AFP)是哺乳動(dòng)物胚胎血清中的主要組分，它在圍產(chǎn)期發(fā)育過(guò)程中由胚胎肝臟和卵黃囊合成。出生后血清中的AFP水平立即急劇下降并且其表達(dá)在正常成人個(gè)體中變得無(wú)法檢測(cè)(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。在肝臟腫瘤和種系發(fā)生的(germinogenic)畸胎細(xì)胞瘤惡性發(fā)展后AFP合成重新開(kāi)始并且在肝臟化學(xué)和機(jī)械損傷的情況下(伴隨再生)，例如，在急性病毒性肝炎或肝硬化過(guò)程中可以檢測(cè)到較少的程度(MizejewskyG.J.，2002，ExpertRev.Anticancer.Ther.289-115)。人AFP是由590個(gè)氨基酸組成的糖蛋白并包括約4％的糖類組分(MorinagaT.，等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，80，4604-4608；PucciP.等人，1991，Biochemistry30，5061-5066)。AFP的一個(gè)主要特性是非共價(jià)吸附不同的低分子化學(xué)物質(zhì)，例如多不飽和脂肪酸、類固醇激素、金屬、類視黃醇、疏水性抗生素及其他(AusselS.&MasseyeffR.，1994，Biochem.Biophys.Res.Commun.1191122-1127；DeutschH.F.，1994，J.TumorMarkerOncol.，911-14)。在胚胎發(fā)育早期，AFP代替白蛋白作為脂肪酸及其他低分子物質(zhì)的運(yùn)輸工具(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。AFP分子由3個(gè)球形結(jié)構(gòu)域組成，所述結(jié)構(gòu)域由15個(gè)鏈間二硫鍵結(jié)合，這顯著增加了蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)裝配過(guò)程的復(fù)雜性(MorinagaT.，等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80，4604-4608；PucciP.，等人，1991，Biochemistry30，5061-5066)。此外，AFP分子的重要結(jié)構(gòu)元件是糖類組分，它提供了分子的正確接納和功能(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。除由590個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈之外，依照N型糖基化，血清胚胎AFP或由肝癌細(xì)胞分泌的AFP分子結(jié)構(gòu)包括一個(gè)與天冬酰胺(asparagin)連接的寡糖基團(tuán)(YamashitaK.等人，1993，CancerRes.532970-2975)。AFP寡糖鏈的結(jié)構(gòu)是異質(zhì)的并且取決于不同因素肝癌發(fā)展階段或胚胎發(fā)育階段。影響AFP分子結(jié)構(gòu)特性的寡糖可以包括在抗原決定簇和受體結(jié)合中心中(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。與血清AFP不同，在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的重組AFP不是糖基化的，這是Murgita工作中表征的產(chǎn)物特征性差異(美國(guó)專利6,331,611；6,627,440；6,416,734)，并且因此具有使其與血清類似物并且也與酵母系統(tǒng)中表達(dá)的重組AFP區(qū)別開(kāi)的結(jié)構(gòu)和功能特性。已知異源蛋白在酵母中表達(dá)時(shí)，其糖基化的進(jìn)行就氨基酸殘基而言與血清類似物中的相同，但就鏈的組成、長(zhǎng)度和分支而言，寡糖自身的結(jié)構(gòu)明顯不同，這也預(yù)先確定了相應(yīng)蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)和功能特性方面的必然差異(HardK.等人，1998，F(xiàn)EBSLett.248111)。AFP可以被表達(dá)特異性AFP受體(AFPR)的細(xì)胞選擇性吸收，所述細(xì)胞例如胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞、活化的免疫細(xì)胞、癌細(xì)胞或由某些類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(UrielJ.等人，1989，inJizejewskyG.I.，JakobsonH.I.(eds)BiologicalPropertiesofAlpha-Fetoprotein.BocaRaton，CRCPress，vol.2103-117)。正常的成熟細(xì)胞喪失了吸收AFP的能力并且不表達(dá)特異性AFPR?？紤]到AFP的這種特性，已提出關(guān)于AFP治療用途的方法以便向腫瘤靶向輸送抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞抑制劑及其他物質(zhì)(DeutschH.F.，1994，J.TumorMarkerOncol.911-14；TsukadaY.等人，1994，J.TumorMarkerOncol.999-103)。AFP具有眾多的功能特性，目前所述功能特性正在深入研究。AFP作為胚胎血清白蛋白類似物的傳統(tǒng)概念目前已由關(guān)于AFP執(zhí)行細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和按程序死亡調(diào)節(jié)能力的數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)充(MizejewskyG.J.，2002，ExpertRev.Anticancer.Ther.289-115)。特別是，與血清和培養(yǎng)類似物相似的重組AFP顯示能夠抑制雌激素依賴性腫瘤和正常組織的生長(zhǎng)(BennettJ.A.等人，1997，BreastCancerRes.Treat.45，169-179；BennetJ.A.等人1998，ClinicalCancerResearch，4，2877-2884)。近來(lái)，確定了AFP的腫瘤抑制活性根據(jù)觸發(fā)凋亡的機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述凋亡的特征為典型的形態(tài)學(xué)改變、生長(zhǎng)停滯、細(xì)胞毒性以及DNA斷裂(SemenkovaL.N.，1997，TumorBiol.18，261-274；DudichE.I.，等人，1998，TumorBiol.19，30-40；DudichE.I.，等人，1999，Eur.J.Biochem.2661-13；SemenkovaL.，等人，2003，Eur.；J.Biochem.704388-4399)。早期研究顯示了AFP調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化和活化的能力。特別是，AFP能夠抑制由同種抗原或自身抗原激活的免疫細(xì)胞并且能夠抑制各種細(xì)胞因子基因表達(dá)(YamashitaK.，等人，1993，CancerRes.53，2970-2975；美國(guó)專利號(hào)5,965,528)。另一方面，AFP誘導(dǎo)未成熟的骨髓細(xì)胞、干細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的顯著刺激生長(zhǎng)(DudichE.I.，等人，1998，TumorBiol.19，30-40；美國(guó)專利號(hào)6,627,440)。AFP的這些特性，以及體內(nèi)癌細(xì)胞吸收AFP的增加的選擇性(UrielJ.，等人，1989，inMizejewskyG.I.，JakobsonH.I.，edsBiologicalPropertiesofAlpha-Fetoprotein.BocaRaton，CRCPress，vol.2103-117)，揭示其在自身免疫(美國(guó)專利號(hào)5,965,528)和腫瘤疾病(美國(guó)專利號(hào)6,416,734；MizejewskyG.J.，2002，ExpertRev.Anticancer.Ther.289-115)治療中作為治療制劑的藥物用途的基礎(chǔ)。此外，AFP通常被用作關(guān)于腫瘤疾病早期診斷和胚胎發(fā)育病理的腫瘤胚胎標(biāo)記(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。然而，由于原料缺乏，天然AFP用作藥物在技術(shù)上是不可能的。獲得AFP的通常來(lái)源是孕婦的血清、胚胎臍帶血清或癌癥患者的腹水。很明顯這些來(lái)源沒(méi)有一個(gè)適合于生產(chǎn)醫(yī)療用途的蛋白物質(zhì)，因?yàn)?，首先，原料?lái)源的獲取是非常有限的并且其中的AFP含量很低，其次，存在不斷增長(zhǎng)的感染病毒或朊病毒的危險(xiǎn)。公開(kāi)了涉及重組AFP(rAFP)在不同微生物中表達(dá)和純化的早期數(shù)據(jù)(YamamotoR.，等人，1990，LifeSciences，461679-1686；NishiS.，等人，1988，J.Biochem.104968-972；美國(guó)專利5,206,153；美國(guó)專利6,331,611)。因此，在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)(YamamotoR.，等人，1990，LifeSciences，461679-1686；美國(guó)專利5,206,153)和大腸桿菌(Escherichiacoli)(美國(guó)專利6,331,611；BoismenuR.，等人，1997，ProteinExpressionandPurification.1010-26)中進(jìn)行了人rAFP的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)。在大腸桿菌中表達(dá)的重組AFP顯示保留了胚胎類似物的免疫調(diào)節(jié)和腫瘤抑制活性(BoismenuR.，等人，1997，ProteinExpressionandPurification.1010-26；BennettJ.A.，等人，1997，BreastCancerRes.Treat.45，169-179)。這些表達(dá)系統(tǒng)的主要缺陷是不能分泌異源蛋白及其生產(chǎn)水平極低。此外，從重組生產(chǎn)菌株生物量獲得所需產(chǎn)物需要執(zhí)行另外的變性和復(fù)性操作，這導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量顯著減少并因此實(shí)際上增加其成本。同樣地，在使用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的情況下，具有已知的內(nèi)毒素活性的外殼脂多糖污染產(chǎn)物的問(wèn)題同樣重要。與本發(fā)明最相似的技術(shù)解決方案是參考文獻(xiàn)中所述人AFP生產(chǎn)菌株(YamamotoR.，等人，1990，LifeSciences，461679-1686；美國(guó)專利5,206,153)。在這些來(lái)源中公開(kāi)了細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)人AFP的酵母生產(chǎn)菌株啤酒糖酵母，其氨基酸序列包括與大鼠AFP信號(hào)肽對(duì)應(yīng)的附加部分。本發(fā)明鑒別了酵母菌株的產(chǎn)物分泌，這個(gè)產(chǎn)物具有成熟人AFP的特性并且具有SEQIDNO2的原始序列，這對(duì)應(yīng)成熟的人AFP的序列。這個(gè)特異性使本發(fā)明中描述的產(chǎn)物顯著超過(guò)早期所公開(kāi)的(YamamotoR.，等人，1990，LifeSciences，461679-1686；美國(guó)專利5,206,153)。此外，所引用的參考文獻(xiàn)中描述的這種菌株的缺點(diǎn)是缺少細(xì)胞內(nèi)裝配以及將AFP分泌到培養(yǎng)液中的機(jī)制，這明顯增加了成本，使得以制備量制備純化的重組AFP的方法更加復(fù)雜并且提供了極低水平的AFP產(chǎn)物。此外，所引用工作的作者(YamamotoR.，等人，1990，LifeSciences，461679-1686；美國(guó)專利5,206,153)獲得了修飾的重組AFP，其序列也包括信號(hào)和連接肽，這限制了其醫(yī)療用途的可能性，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾導(dǎo)致免疫特異性的改變并且其結(jié)果是增加了靜脈內(nèi)或皮下施用的免疫反應(yīng)病理危險(xiǎn)。在酵母細(xì)胞異源分泌生產(chǎn)蛋白的情況下，為了使正確折疊伴隨二硫鍵形成發(fā)生(在它們中AFP)，重要的是生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)酵母二硫化物異構(gòu)酶(Pdi)的產(chǎn)生水平(ShustaE.V.，等人，1998，Nat.Biotechnol.16773-777)。此外，這種酶的協(xié)同作用由增加量的shaperon樣酵母蛋白BiP提供(RobinsonA.S.，等人，1996，J.Biol.Chem.27110017-10022)。盡管事實(shí)上酵母通常被認(rèn)為是不含被分泌的蛋白水解酶的生物(ChungB.H.&ParkK.S.，1998，Biotechnol.Bioeng.57245-249)，對(duì)于眾多蛋白質(zhì)，包括——對(duì)于HSA，顯示了它們?cè)诮湍概囵B(yǎng)過(guò)程中的降解，這涉及與細(xì)胞相關(guān)的仍未鑒別的蛋白水解酶的存在(ChungB.H.&ParkK.S.，1998，Biotechnol.Bioeng.57245-249；KangH.A.，等人，2000，Appl.Microbiol.Biotechnol.53575-582)。所有被列出的因素需要在創(chuàng)建AFP有效地分泌在培養(yǎng)液中的酵母生產(chǎn)者的過(guò)程中對(duì)它們加以考慮?？紤]到目前制備重組AFP的方法中存在的缺點(diǎn)，明顯需要進(jìn)一步改進(jìn)關(guān)于表達(dá)并分泌重組AFP的系統(tǒng)的技術(shù)，特別是開(kāi)發(fā)具有較高異源蛋白表達(dá)能力的新型重組菌株，提供天然三級(jí)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞內(nèi)裝配以及隨后所需產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液中。因此，需要開(kāi)發(fā)工業(yè)上可用的AFP制備方法，所述AFP就其特性而言將與人血清AFP相同或相似，并且因此將使得它能夠用于人血清AFP通常使用的那些領(lǐng)域中。通過(guò)創(chuàng)建微生物的新型菌株可以完成所述目標(biāo)，所述菌株可以在培養(yǎng)基中生產(chǎn)就其特性而言與人血清AFP相同或相似的多肽。發(fā)明概述為了制備其特性將與人血清AFP特性相同或相似的重組AFP，必須開(kāi)發(fā)提供被分泌的可溶形式AFP合成及生產(chǎn)的生產(chǎn)菌株。利用基因工程方法通過(guò)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化親本菌株獲得生產(chǎn)菌株，所述質(zhì)粒包括編碼具有成熟的人AFP活性的蛋白的DNA序列。在酵母表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)的重組被分泌AFP具有與成熟的人AFP相同或相似的特性，這在免疫學(xué)分析中以及通過(guò)其抑制B細(xì)胞淋巴瘤Raji及其他人細(xì)胞系細(xì)胞生長(zhǎng)的能力得到確定，所述細(xì)胞在體外培養(yǎng)中對(duì)促凋亡作用敏感。這使所獲得的AFP和成熟的人血清AFP具有相同的作用機(jī)制，所述獲得的AFP通過(guò)常規(guī)方法獲得并具有如SEQIDNO2所呈現(xiàn)的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的AFP制備方法的執(zhí)行條件提供與天然人AFP相比具有最小缺陷的多肽裝配。在酵母中生產(chǎn)的人重組AFP與人血清AFP特性的近似性由質(zhì)粒組成中包含的表達(dá)盒提供，所述表達(dá)盒包括編碼成熟的人AFP的DNA序列，其中分離過(guò)程不要求變性-復(fù)性步驟，并且同時(shí)提供所獲得多肽的糖基化以及分子折疊和二硫鍵的形成。在酵母表達(dá)系統(tǒng)中以被分泌的形式生產(chǎn)的重組人AFP與在原核表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)的重組類似物的不同之處在于前者依照N型進(jìn)行糖基化，而專利(MurgitaR.A.美國(guó)專利6,331,611；6,627,440；6,416,734)中所描述的重組細(xì)菌AFP是非糖基化的。在酵母表達(dá)系統(tǒng)中以被分泌的形式生產(chǎn)的人重組AFP通過(guò)寡糖鏈的組成和結(jié)構(gòu)不同于血清類似物，所述寡糖鏈的組成和結(jié)構(gòu)由酵母菌株和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中所包括糖類的組成決定。為了從宿主細(xì)胞獲得具有所需活性的高產(chǎn)量的分泌蛋白，向編碼AFP基因的質(zhì)粒中加入幾種另外的基因，所述另外的基因提供高水平的基因轉(zhuǎn)錄、分泌過(guò)程中的蛋白質(zhì)折疊以及二硫鍵的正確形成。因此獲得了具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于表達(dá)并分泌AFP能力的pKX質(zhì)粒。利用上述質(zhì)粒獲得了具有分泌重組甲胎蛋白能力的真核生產(chǎn)細(xì)胞。在優(yōu)選變異體中，受體菌株啤酒糖酵母YBS723被用作原始細(xì)胞，用pKX質(zhì)粒轉(zhuǎn)化這種菌株以獲得生產(chǎn)菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX，它保存于俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(RussianCollectionofIndustrialMicroorganisms)(VKPM)，保藏號(hào)Y-3115。在轉(zhuǎn)化菌株的培養(yǎng)過(guò)程中，AFP被分泌到培養(yǎng)基中，從所述培養(yǎng)基中它可以利用傳統(tǒng)的生物化學(xué)方法以純化的形式被分離。從轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得的被分離的AFP用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物組合物中，所述藥物組合物包括所獲得的AFP以及藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑。被分離的AFP用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同組合物中，所述協(xié)同組合物包括所獲得的AFP和化學(xué)治療制劑以及藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑。利用所分離的AFP，已開(kāi)發(fā)了以其為基礎(chǔ)的藥物組合物或包括其的協(xié)同組合物，治療癌癥或阻止癌癥發(fā)展的方法，所述方法設(shè)想給患者施用有效量的AFP、藥物組合物或協(xié)同組合物。由于所獲得的AFP就特性而言與人血清AFP相似，因此所獲得的AFP用于具有免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)作用的協(xié)同組合物中，其中所述組合物包括AFP和環(huán)孢菌素C以及藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑。已開(kāi)發(fā)了利用被分離的AFP或上述協(xié)同組合物治療自身免疫性疾病并調(diào)整免疫狀態(tài)的方法，所述方法包括給患者施用有效量的AFP或含環(huán)孢菌素C的協(xié)同組合物。考慮到AFP能夠刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)，本發(fā)明人已提出刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物組合物，所述組合物包括所獲得的AFP以及藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，并且還提出了刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同組合物，這種組合物包括所獲得的AFP和維生素A、E、D的衍生物、抗氧化劑、類固醇激素、植物來(lái)源的異黃酮以及藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑。提出了利用被分離的AFP、上述藥物或協(xié)同組合物在體外刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包括用有效量的AFP或相應(yīng)的組合物作用于細(xì)胞。此外，提出了在體內(nèi)刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包括給患者施用有效量的AFP或上述藥物或協(xié)同組合物。在被分離的AFP功能活性的基礎(chǔ)上提出了使皮膚更新并防止皮膚衰老的化妝品組合物，所述組合物包括所獲得的AFP以及美容學(xué)上可接受的載體和賦形劑，以及任選的維生素A、E、D的衍生物、抗氧化劑、類固醇激素、植物來(lái)源的異黃酮。在本發(fā)明的框架內(nèi)提出了利用所獲得的化妝品組合物使皮膚更新并防止皮膚衰老的方法，所述方法包括在個(gè)體皮膚上應(yīng)用所述組合物。附圖簡(jiǎn)述下列圖舉例說(shuō)明了本發(fā)明所提出的主題。附圖1顯示了編碼成熟的人甲胎蛋白序列的pKX質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，包括含人甲胎蛋白基因的表達(dá)盒；細(xì)菌質(zhì)粒pUC18的片段；2-μm酵母質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)；選擇性PGK1酵母標(biāo)記、編碼二硫化物異構(gòu)酶的PD11基因和提供蛋白質(zhì)正確裝配并將所需產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中的KAR2基因。附圖2顯示了在pKX質(zhì)粒組成中的表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)，所述表達(dá)盒包括編碼人甲胎蛋白的序列。GAL1酵母基因的啟動(dòng)子區(qū)由斜體字顯示。MFα1酵母基因的分泌前原區(qū)(pre-proregion)由黑印刷體顯示。人甲胎蛋白分子的氨基酸序列由大寫(xiě)字母顯示。附圖3表示編碼AFP并且由最常用的酵母密碼子組成的合成基因的結(jié)構(gòu)。與血清人AFP的氨基酸序列相同的AFP氨基酸序列用黑印刷體指出。附圖4顯示了在一條線上應(yīng)用的不同量的純化重組甲胎蛋白的SDS-PAGE電泳(A)和免疫印跡分析(B)結(jié)果，所述重組甲胎蛋白從酵母培養(yǎng)物啤酒糖酵母YBS723/pKX培養(yǎng)液中獲得。1.標(biāo)記蛋白(94、67、43、30、20kD)。2.在含抗-AFP-瓊脂糖的柱上親和層析后的rAFP(0.3μg)。3.在含SephacrylS-200的柱上凝膠層析后的rAFP(0.4μg)。4.rAFP(0.1μg)。5.SephacrylS-200后的rAFP(0.6μg)。6.SephacrylS-200后的rAFP(0.5μg)。7.胚胎eAFP(0.4μg)。附圖5顯示了B細(xì)胞Raji淋巴瘤細(xì)胞對(duì)兩種不同純化AFP樣本的AFP濃度的劑量依賴性增殖，所述樣本從胚胎血清e(cuò)AFP和重組rAFP獲得，所述重組rAFP由酵母生產(chǎn)菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX表達(dá)。在與AFP一起孵育12小時(shí)后的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物中相對(duì)于無(wú)添加的對(duì)照通過(guò)摻入[H3]-胸腺嘧啶核苷測(cè)量細(xì)胞的增殖并以生長(zhǎng)抑制百分比表示。附圖6證明(A)就成髓細(xì)胞瘤U937細(xì)胞而言，與根據(jù)本發(fā)明rAFP組合使用的阿霉素腫瘤抑制作用的協(xié)同增強(qiáng)作用；(B)與根據(jù)本發(fā)明rAFP和視黃酸(維生素原A酸)組合使用的一般腫瘤抑制效應(yīng)的協(xié)同增強(qiáng)作用。在與AFP一起孵育12小時(shí)后的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物中相對(duì)于無(wú)添加的對(duì)照通過(guò)摻入[H3]-胸腺嘧啶核苷測(cè)量細(xì)胞的增殖并以生長(zhǎng)抑制百分比表示。附圖7顯示根據(jù)本發(fā)明的rAFP對(duì)胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激作用，所述細(xì)胞從胚胎肺和視網(wǎng)膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)中獲得。通過(guò)在培養(yǎng)最后4小時(shí)內(nèi)摻入[H3]-胸腺嘧啶核苷的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量細(xì)胞的增殖并以測(cè)試培養(yǎng)物中相對(duì)于無(wú)AFP對(duì)照的生長(zhǎng)刺激百分比表達(dá)。序列表包括序列SEQIDNO1和SEQIDNO2，它們分別為表達(dá)盒的核苷酸序列以及成熟的人AFP的氨基酸序列，所述表達(dá)盒在pKX質(zhì)粒的組成中并且包括人甲胎蛋白的編碼序列。表達(dá)盒的核苷酸序列包括GAL1酵母基因的啟動(dòng)子區(qū)、MFα1酵母基因的分泌前原區(qū)、人甲胎蛋白基因的編碼序列以及CYC1酵母基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。這個(gè)表達(dá)盒包括在pKX質(zhì)粒中，所述pKX質(zhì)粒在酵母生產(chǎn)菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX系統(tǒng)中編碼成熟的人甲胎蛋白的序列。發(fā)明詳述為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，主要的技術(shù)目標(biāo)是創(chuàng)建能將所需蛋白有效分泌到培養(yǎng)液中的AFP酵母生產(chǎn)菌株。通過(guò)構(gòu)建編碼調(diào)節(jié)合成的人AFP的重組DNApKX質(zhì)粒以及啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株來(lái)解決這個(gè)目標(biāo)，所述菌株提供以被分泌的溶解形式合成和生產(chǎn)并且表達(dá)水平不低于10mg/l的AFP。提供了以被分泌的溶解形式的高水平合成的所需蛋白，其中pKX質(zhì)粒包括GAL1基因的啟動(dòng)子與同時(shí)擴(kuò)增的KAR2基因(RobinsonA.S.，等人，1996，J.Biol.Chem.27110017-10022)，所述KAR2基因編碼伴侶重鏈結(jié)合蛋白BiP。在受體菌株的基因組中，存在編碼二硫化物異構(gòu)酶的PD11基因擴(kuò)增(RobinsonA.S.，等人，1996，J.Biol.Chem.27110017-10022)，所述酶在蛋白質(zhì)分泌過(guò)程中參與形成二硫鍵。重組質(zhì)粒DNA包括在GAL1啟動(dòng)子基因控制下的人AFP基因以及編碼伴侶重鏈結(jié)合蛋白BiP的KAR2基因，所述GAL1啟動(dòng)子基因提供高水平的基因轉(zhuǎn)錄，所述KAR2基因在蛋白質(zhì)分泌過(guò)程中參與蛋白質(zhì)折疊，并在培養(yǎng)液中提供高水平的所需蛋白產(chǎn)物。此外，為了提供二硫鍵的正確形成以及蛋白質(zhì)天然三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，使用編碼二硫化物異構(gòu)酶的PS11基因。編碼人AFP基因的重組pKX質(zhì)粒DNA(附圖1)具有下述特征-它是有效分泌人AFP的表達(dá)質(zhì)粒；-它具有13301bp的大??；-它包括編碼成熟人甲胎蛋白的氨基酸序列SEQIDNO2的片段；-它包括細(xì)菌質(zhì)粒pUC18的片段；2-μm酵母質(zhì)粒的起始區(qū)；選擇性酵母標(biāo)記PGK1；編碼伴侶重鏈結(jié)合蛋白BiP的KAR2酵母基因；編碼二硫化物異構(gòu)酶的PD11基因；含AFP基因組的表達(dá)盒；-由核苷酸序列SEQIDNO1呈現(xiàn)的表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)中包括GAL1酵母基因的啟動(dòng)子區(qū)；MFα1酵母基因的分泌前原區(qū)；編碼成熟的人AFP的區(qū)域；CYC1酵母基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。當(dāng)這個(gè)質(zhì)粒被導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)，由于使用了高度有效的GAL1啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)了AFP基因的高水平轉(zhuǎn)錄。如果編碼區(qū)將對(duì)應(yīng)編碼成熟的人AFP的DNA序列，則MFα1分泌前原區(qū)的導(dǎo)入為培養(yǎng)液中具有期望的氨基酸序列SEQIDNO2的蛋白質(zhì)的AFP提供正確的分泌過(guò)程以及有效地分泌；-所提出的質(zhì)粒構(gòu)建物的顯著特征在于afp基因在高度有效的GAL1啟動(dòng)子的控制下，并且為了提供二硫鍵的正確形成以及蛋白質(zhì)天然三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，使用PD11和KAR2基因。對(duì)所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化敏感的任何真核細(xì)胞均可用所創(chuàng)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。細(xì)胞的選擇不是關(guān)鍵，因?yàn)檗D(zhuǎn)化方法和步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。然而，取決于所獲得的轉(zhuǎn)化株的細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件，AFP的表達(dá)水平可以改變，但表達(dá)所需肽將在親本細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化的條件下發(fā)生?；蛐蚿gk1/pgk1的受體菌株YBS723用于獲得啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株。pgk1/pgk1的純合性使得這種菌株不能在包含任何單一碳源的所有培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述碳源在啤酒糖酵母正常消化范圍之內(nèi)。gal80∷PD11/gal80∷PD11的純合性導(dǎo)致GAL1基因啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)改變與PD11基因基因組的同時(shí)增殖，所述PD11基因編碼二硫化物異構(gòu)酶并在蛋白質(zhì)分泌過(guò)程中參與二硫鍵形成。利用根據(jù)本方法的pKX質(zhì)粒轉(zhuǎn)化YBS723菌株(ItoH.，等人，1983，J.Bacteriol.153163-168)。根據(jù)在包括2％葡萄糖作為碳源的全價(jià)酵母培養(yǎng)基(細(xì)菌用蛋白胨-20g/l，酵母提取物-10g/l，細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂-20g/l)上的生長(zhǎng)能力選擇轉(zhuǎn)化株。一種此類克隆被命名為YBS723/pKX。所獲得的二倍體酵母菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX具有下述特征遺傳特征基因型pgk1/pgk1gal80∷PD11/gal80∷PD11；形態(tài)學(xué)特征在含2％葡萄糖作為唯一碳源的固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48小時(shí)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)細(xì)胞具有橢圓形的形狀，細(xì)胞大小為3.6×7.1μm，原生質(zhì)為均質(zhì)的，通過(guò)出芽生殖進(jìn)行再生。當(dāng)在包含酵母提取物和蛋白胨的固體培養(yǎng)基(YEP)上30℃生長(zhǎng)72小時(shí)后，柱具有下述外觀1)在含葡萄糖的YEP培養(yǎng)基上-白色柱邊緣光滑、表面發(fā)亮、錐形輪廓、乳膏樣粘度；2)在含淀粉的YEP培養(yǎng)基上-白色柱邊緣有圖案、表面暗淡、晶狀體樣輪廓以及顆粒粘度；3)在含糖蜜的YEP培養(yǎng)基上-白色柱表面暗淡有皺紋、邊緣有圖案、凸?fàn)钶喞约叭楦鄻诱扯?；在液體培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)-在含淀粉的YEP培養(yǎng)基上32℃時(shí)在培養(yǎng)開(kāi)始的24小時(shí)內(nèi)-液體混濁、殘?jiān)鼮榘咨?、不結(jié)塊、不形成側(cè)壁薄膜。物理化學(xué)特征兼性厭氧菌。生長(zhǎng)溫度23-33℃(最佳溫度31℃)。培養(yǎng)pH值3.8-6.7(最佳pH值5.0)。在pH6.8-7.0時(shí)觀察到AFP分泌的最高水平。碳源的同化發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、糊精、淀粉。氮源的同化同化氨基酸、尿素、硫酸銨、硝酸銨。獨(dú)特的特異性在含淀粉(2％)的豐富培養(yǎng)基上培養(yǎng)的情況下，培養(yǎng)皿在+4℃孵育24小時(shí)后，淀粉褪色帶被深色邊環(huán)繞。病原性啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株是非致病的。保存方法菌株在含葡萄糖的瓊脂化(agarized)豐富培養(yǎng)基內(nèi)+4℃保存3個(gè)月。所獲得的啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株(分泌形式的AFP的生產(chǎn)者)被存放在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，保藏號(hào)Y-3115。由申請(qǐng)人提出的重組AFP的細(xì)胞生產(chǎn)菌株具有超過(guò)已存在原型的眾多優(yōu)點(diǎn)-所需產(chǎn)物的產(chǎn)生以被分泌到培養(yǎng)液中的形式實(shí)現(xiàn)；-最終產(chǎn)物的氨基酸序列對(duì)應(yīng)成熟的人AFP的序列-SEQIDNO2；-與血清胚胎類似物相似，由生產(chǎn)菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX生產(chǎn)的rAFP是糖基化的；-由于PD11基因表達(dá)以及KAR2基因表達(dá)的增加，所需產(chǎn)物的產(chǎn)量顯著增加，所述PD11基因編碼二硫化物異構(gòu)酶，提供二硫鍵形成，所述KAR2基因編碼伴侶重鏈結(jié)合蛋白BiP，提供蛋白質(zhì)的正確裝配以及所需產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。非常明顯編碼DNA的序列可以包括與遺傳密碼簡(jiǎn)并性相關(guān)的置換，并且還包括就整體而言不會(huì)導(dǎo)致得到無(wú)活性形式胎蛋白的某些置換、插入、刪除。可能的變異是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所獲得的多肽還可包括在氨基酸序列框內(nèi)的保守氨基酸置換，前提是一個(gè)氨基酸被另一個(gè)具有相似特性的氨基酸置換。然而，在本發(fā)明所要求特征的限制內(nèi)，只存在具有一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的那些多肽，所述結(jié)構(gòu)不會(huì)擾亂所獲得多肽的所需活性，特別是-具有與成熟的人AFP特性相同或相似的特性，所述特性在免疫學(xué)分析中并且根據(jù)其在體外培養(yǎng)中抑制B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞生長(zhǎng)的能力進(jìn)行確定。認(rèn)為所獲得的多肽將具有成熟的人血清AFP特性的功能活性指數(shù)根據(jù)免疫反應(yīng)并且根據(jù)其體外抑制B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞生長(zhǎng)的能力在不低于成熟的人血清AFP活性10％的水平進(jìn)行確定。在所得多肽在組合物中的特殊用途情況下，使用傳統(tǒng)的另外組分，例如賦形劑、稀釋劑、防腐劑、緩沖液、生理溶液、0.9％氯化鈉溶液、在藥物劑型生產(chǎn)過(guò)程中使用的工藝添加劑等。組合物可以是用作腸胃外、口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)等施用或供外部使用的流體(溶液、懸浮液、乳膏、乳狀液等)、固體(在使用前重構(gòu)的凍干粉劑、吸附在載體上的制劑等)。其中，供外部使用的組合物可以包括促進(jìn)活性物質(zhì)在組織中吸收和擴(kuò)散的添加劑。本發(fā)明的協(xié)同組合物提供另一種活性物質(zhì)在組合物中的存在，其中在兩種活性物質(zhì)同時(shí)存在(其中之一為根據(jù)本發(fā)明的AFP)的情況下，它們的作用效果確實(shí)比每種物質(zhì)分開(kāi)使用的情況更高。非常明顯，協(xié)同組合物是本發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選方案，因?yàn)閷?duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)每種活性組分分開(kāi)施用是顯而易見(jiàn)的。例如，在抗癌治療的情況下，每種活性組分制劑可以分開(kāi)施用以及一起同時(shí)施用，伴隨時(shí)間上或不同施用方式的分開(kāi)。具體的選擇取決于患者的狀態(tài)、疾病的嚴(yán)重度、先前的治療等。治療用的治療劑量的選擇可以是0.001-10mg/kg患者體重的廣泛范圍內(nèi)的任何劑量，附加條件是獲得所需療效。它對(duì)應(yīng)人AFP的常規(guī)劑量，因?yàn)樗@得的AFP將具有就活性而言相似或接近的特性。根據(jù)本發(fā)明的AFP的限制劑量對(duì)應(yīng)人AFP的劑量，因?yàn)樗鼈兙哂邢嗨频陌被嵝蛄?，它不?huì)被正常的人免疫系統(tǒng)識(shí)別為“外來(lái)的”。本發(fā)明由下述實(shí)施例來(lái)舉例說(shuō)明，所述實(shí)施例不是限制性的，但希望證實(shí)本發(fā)明的實(shí)施方案并實(shí)現(xiàn)實(shí)施方案的最佳改變。實(shí)施例1分離總RNA并構(gòu)建中間體重組質(zhì)粒DNApTrcafp利用TrizolReagent(GibcoBRL，USA)依照制造商的方法從人肝癌細(xì)胞株HepG2中分離出總mRNA。利用FirstStrandcDNASynthesisKit(MBIFermentas)在引物寡聚(dT)18或與基因afp3’末端互補(bǔ)的GAAGTAATTTAAACTCCCAAAGC(3R)的存在下得到cDNA。在下列引物的存在下進(jìn)行用于后續(xù)克隆的所得基質(zhì)的擴(kuò)增CTTCAATCGATATGACACTGCATAGAAATG(Cla)CTTCCAAGCTTAAACTCCCAAAGCAG(Hind)，第一個(gè)引物序列對(duì)應(yīng)成熟的蛋白基因的5’序列(用黑印刷體指出)并且包括限制性酶ClaI的識(shí)別位點(diǎn)，而第二個(gè)與基因的3’末端部分互補(bǔ)(用黑印刷體指出)并包括HindIII的識(shí)別位點(diǎn)。在100μl的體積中進(jìn)行基因擴(kuò)增。反應(yīng)混合物包括10ngcDNA、引物(1)和(2)每種30pM、dNTP混合物(每種0.2mM)、10mMpH8.8的Tris-HCl、10mMKCl、2.5mMMgSO4、2.5單位PfuDNA-聚合酶(Stratagene公司)以及1單位的TaqDNA-聚合酶(Fermentas公司)。根據(jù)下述方案進(jìn)行25個(gè)循環(huán)95℃/40秒、39℃/40秒、72℃/1分鐘。通過(guò)在1％瓊脂糖凝膠中電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物；切下長(zhǎng)度約1790bp的條帶，從凝膠中提取DNA，用限制性酶ClaI和HindIII處理并克隆到質(zhì)粒pTrcTEGF中，所述質(zhì)粒pTrcTEGF先前在載體pTrc99A的基礎(chǔ)上得到(AmannE.，等人，1988，Gene，69，301-315)，并且用那些相同的限制性酶處理。從而獲得質(zhì)粒pTrcafp；其結(jié)構(gòu)通過(guò)限制性酶分析并且通過(guò)PCR測(cè)定所克隆的DNA部分的核苷酸序列進(jìn)行確認(rèn)，所述限制性酶分析相對(duì)于所得到的克隆利用限制性酶ClaI和HindIII，并且還可利用識(shí)別位點(diǎn)在AFP基因內(nèi)部的SpeI、MunI、SecI和StyI。根據(jù)方法并利用CycleReaderTMDNASequencingKit(Fermentas，Lithuania)進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例2制備編碼人AFP基因的合成cDNA為了獲得合成的AFP基因，化學(xué)合成長(zhǎng)度為62-68b的36個(gè)寡核苷酸。在這些寡核苷酸的基礎(chǔ)上，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法獲得6個(gè)雙鏈片段，將其中的每一個(gè)都克隆到載體pUC18中。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)所有克隆片段的一級(jí)結(jié)構(gòu)。隨后通過(guò)限制/連接的方法以質(zhì)粒pUC18片段的形式將具有正確核苷酸結(jié)構(gòu)的片段順次連接為所需基因。以類似方式獲得用于表達(dá)修飾形式的AFP的cDNA，所述AFP包括刪除、突變或添加的氨基酸殘基。實(shí)施例3構(gòu)建重組質(zhì)粒DNApKX在引物的存在下質(zhì)粒pTrcafp被用作PCR的模板CAACCCTCGAGTTAAACTCCCAAAGCCCAACCCATGGCTAAGAGAACACTGCATAGAAA-TG。限制性位點(diǎn)NcoI和XhoI(有下劃線的)被設(shè)定在引物序列中。作為擴(kuò)增結(jié)果獲得的DNA片段在限制性核酸內(nèi)切酶NcoI/XhoI處理后克隆到載體pUC18/GAL1-pp中，所述載體包括啟動(dòng)子GAL1以及MFα1的分泌前原區(qū)。從而獲得質(zhì)粒pUC18/GAL1-pp/afp。為了排除PCR可能的錯(cuò)誤，對(duì)質(zhì)粒的NcoI/XhoI片段進(jìn)行測(cè)序。包括啟動(dòng)子GAL1、MFα1的分泌前原區(qū)以及人AFP基因的編碼部分的質(zhì)粒pUC18/GAL1-pp/afp的HindIII/XhoI片段(附圖2)轉(zhuǎn)移到HindIII/XhoI雙復(fù)制子(酵母-大腸桿菌)載體pPDX中。從而得到質(zhì)粒pPDX/GAL1-pp/afp。質(zhì)粒pPDX/GAL1-pp/afp的ClaI/XhoI片段轉(zhuǎn)移到pPX的ClaI/XhoI載體中，所述pPX由于KAR2基因的存在而不同于pPDX。從而得到的質(zhì)粒被命名為pKX(附圖1)。以類似的方式得到質(zhì)粒pKX-1，它包括由最廣泛使用的酵母密碼子組成的合成人AFP基因(附圖3)。質(zhì)粒pKX-1與pKX的不同之處在于前者包括成熟的人AFP的合成基因。實(shí)施例4獲得人AFP的生產(chǎn)菌株為了獲得啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株，依照方法用質(zhì)粒pPX轉(zhuǎn)化受體菌株YBS723(ItoH.，等人，1983，J.Bacteriol.153163-168)。根據(jù)在包括2％葡萄糖作為碳源的全價(jià)酵母培養(yǎng)基(細(xì)菌用蛋白胨-20g/l，酵母提取物-10g/l，細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂-20g/l)上的生長(zhǎng)能力選擇轉(zhuǎn)化株。一種此類克隆被命名為YBS723/pKX。實(shí)施例5測(cè)定人AFP生產(chǎn)菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX的生產(chǎn)能力生產(chǎn)菌株YBS723/pKX的細(xì)胞在管形瓶中26℃在搖床上(250rpm)在下述組成的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)葡萄糖-2％、甘油-1.5％、酵母提取物-1％、蛋白胨-2％、蒸餾水。通過(guò)加入0.1M的磷酸鹽緩沖液使培養(yǎng)基的pH值維持在7.0。細(xì)胞的初始滴定度為5×106。在培養(yǎng)物生長(zhǎng)72小時(shí)過(guò)渡到生長(zhǎng)平穩(wěn)期后滴定度為7-8×108時(shí)進(jìn)行取樣。培養(yǎng)物10000rpm離心1分鐘后獲得培養(yǎng)液的樣本并用于下述分析。在含十二烷基硫酸鈉的12.5％聚丙烯酰胺凝膠上通過(guò)電泳分析CL樣本。凝膠用CoomassieR-250染色(附圖4)并掃描以確定總蛋白質(zhì)以及AFP特異性蛋白的相對(duì)含量。根據(jù)電泳和掃描的數(shù)據(jù)，CL中的AFP總含量為約10-25％的總蛋白質(zhì)，但存在蛋白質(zhì)的部分細(xì)胞內(nèi)降解。在AFP多克隆抗體的存在下通過(guò)免疫印跡法確定CL中的AFP相對(duì)含量(附圖4)。同樣地，利用一套針對(duì)人AFP的單克隆和多克隆抗體通過(guò)免疫酶分析(IEA)法確定培養(yǎng)液中的AFP定量含量。根據(jù)IEA數(shù)據(jù)，液體培養(yǎng)基中CL的AFP平均含量達(dá)到5mg/l。實(shí)施例6測(cè)定人AFP生產(chǎn)菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX在高密度培養(yǎng)基中的生產(chǎn)能力在發(fā)酵罐中在26℃和pH7.0時(shí)(自動(dòng)維持)進(jìn)行菌株YBS723/pKX的分批補(bǔ)料培養(yǎng)。維持＞20％的溶解氧dO含量。在發(fā)酵過(guò)程中，進(jìn)行含下述組成培養(yǎng)基的補(bǔ)充酵母提取物-10g/l、蛋白胨-60g/l、葡萄糖-100g/l。補(bǔ)充物的供應(yīng)速度是這樣的以至提供μ＝0.03的培養(yǎng)物生長(zhǎng)速度。達(dá)到與280個(gè)光學(xué)單位相等的OD50后，分析CL中的AFP含量。如上述實(shí)施例4中所述確定YBS723/pKX高密度培養(yǎng)的CL中的AFP相對(duì)和總含量。在高密度培養(yǎng)的情況下，根據(jù)IFA數(shù)據(jù)CL中的rAFP含量達(dá)到70mg/l。實(shí)施例7分離并鑒定來(lái)自生產(chǎn)菌株YBS723/pKX的CL的重組人AFP如早先所述(Dudich等人，1999，Biochemistry，3810406-10414)并稍加改變進(jìn)行來(lái)自生產(chǎn)菌株YBS723/pKX的CL的rAFP分離。通過(guò)在濃縮室“Millipore”上超濾將培養(yǎng)液從31濃縮至200ml并對(duì)pH7.5的0.005MTris-HCl、0.1MNaCl緩沖液在4℃進(jìn)行透析，并隨后在10000rpm離心0.5小時(shí)。離子交換層析。對(duì)離心后得到的上清液應(yīng)用離子交換柱DEAE-SepharoseFastFlow(Pharmacia，27×4cm)，用pH7.5的0.01MTris-HCl、0.1MNaCl平衡該柱。用起始緩沖液從柱上洗去沒(méi)有與吸附劑結(jié)合的組分，而用pH7.5含0.2MNaCl的Tris-HCl緩沖液以1ml/分鐘的速度進(jìn)行所需產(chǎn)物的洗脫。親和層析。包含rAFP的級(jí)分進(jìn)行合并，NaCl濃度恢復(fù)到0.5M并應(yīng)用于含與多克隆抗-AFP兔抗體綴合的SepharoseCL-4B的親和層析柱，該柱用pH7.5的0.05MTris-HCl和0.5MNaCl平衡。沒(méi)有與蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)輸出后，用0.005MHCl洗脫被吸附的rAFP。通過(guò)280nm處的吸收確定pH從5.0達(dá)到3.5后材料的輸出峰。通過(guò)加入pH7.5的2MTris-HCl溶液將rAFP溶液中和至pH7.5。凝膠層析。在含SephacrylS-200的柱(1.8×70cm)上在pH7.0的0.1M磷酸鹽緩沖液和0.15MNaCl中通過(guò)凝膠層析以0.5ml/分鐘的速度進(jìn)行rAFP的進(jìn)一步純化。純化的rAFP溶液在室“Amicon”(膜YM-30)中在氮壓力下進(jìn)行濃縮。樣本分析。通過(guò)方法控制所獲得的rAFP制劑的性質(zhì)和純度，所述方法包括根據(jù)Lammly在含β-巰基乙醇的12.5％SDS-PAGE中凝膠電泳隨后用Coomassie染色(附圖4A)，用滴定度為第一抗體1∶500和第二抗體1∶5000在PVDF膜上的Western印跡分析，在HybondECL-硝化纖維膜上的斑點(diǎn)印跡(附圖4B)，IFA。依照Bredford法，利用胚胎AFP標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照，并且還在278nm處用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，考慮消光系數(shù)E1％，278nm＝0.53，進(jìn)行溶液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。實(shí)施例8測(cè)定重組人AFP在體外的生物學(xué)活性如早先所述(SemenkovaL.N.，1997，TumorBiol.18，261-274；DudichE.I.，等人，1998，TumorBiol.19，30-40)根據(jù)其在體外培養(yǎng)中抑制B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞生長(zhǎng)的能力來(lái)確定rAFP及其修飾形式的功能活性。預(yù)先用新鮮培養(yǎng)基洗滌，在0.1ml的RPMI-1640培養(yǎng)基中在10％胎牛血清的存在下按照5×103將Raji細(xì)胞放置在96孔板的每個(gè)孔中，隨后加入不同劑量的AFP12小時(shí)。通過(guò)在培養(yǎng)的最后4小時(shí)內(nèi)摻入[H3]胸腺嘧啶核苷的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量細(xì)胞的增殖。為了比較，研究胚胎起源的embrAFP和酵母rAFP的兩種AFP樣本的劑量依賴性反應(yīng)(附圖5)。很明顯兩種制劑均顯示關(guān)于這些細(xì)胞的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)活性。類似地，為了測(cè)定以AFP為基礎(chǔ)的制劑的體外活性，對(duì)AFP抑制作用敏感的任何其他癌細(xì)胞株均可使用，例如人肝癌HepG2、乳腺癌MCF-7、前列腺癌LnCap、成髓細(xì)胞瘤U-937及其他(SemenkovaL.N.，1997，TumorBiol.18，261-274；DudichE.I.，等人，1998，TumorBiol.19，30-40)。實(shí)施例9重組AFP作為抗癌制劑的用途以rAFP及其修飾形式為基礎(chǔ)的抗癌制劑可以用于抑制惡性腫瘤的生長(zhǎng)，所述惡性腫瘤例如原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌、血癌(白血性增生、成髓細(xì)胞瘤、淋巴瘤)、乳腺癌、前列腺癌。為了確定這種類型的腫瘤細(xì)胞對(duì)AFP的敏感性，在體外并且同樣在體內(nèi)可以使用不同的方法。測(cè)定體外活性的方法在前述實(shí)施例8中得到描述。為了測(cè)定以AFP為基礎(chǔ)的制劑在體內(nèi)的腫瘤抑制作用，可以使用動(dòng)物模型，例如使用皮下或腹膜內(nèi)植入人癌細(xì)胞株的裸鼠，所述細(xì)胞株例如Raji、HepG2、LnCap、MCF-7及其他。例如，以1-5×106/小鼠的量皮下施用B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞。在腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)植入腫瘤細(xì)胞前7天以1-10mg/kg的量開(kāi)始施用AFP及其衍生物。使用生理學(xué)緩沖液(PBS)作為對(duì)照。利用測(cè)微計(jì)通過(guò)每天測(cè)量來(lái)評(píng)估腫瘤的大小。表1rAFP對(duì)植入B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞的裸系小鼠的測(cè)試結(jié)果以酵母rAFP或其衍生物為基礎(chǔ)的制劑的給藥方法可以包括在其中同時(shí)或順次施用化學(xué)治療制劑。下述可以被提出作為此類化學(xué)治療制劑的實(shí)例阿霉素、長(zhǎng)春新堿、氟尿嘧啶、metatrexate、放線菌素D、絲裂霉素C、它莫西芬、氟他胺、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、環(huán)孢菌素、類視黃醇、類胡蘿卜素及其他。通常地，化學(xué)治療制劑可以以標(biāo)準(zhǔn)劑量或以通常治療之下的亞最佳劑量施用。在附圖6中作為一個(gè)實(shí)例展示了rAFP與阿霉素(A)以及rAFP與全反式維甲酸(tRA)的組合作用效果。在制劑同時(shí)施用的情況下，觀察到亞最佳劑量使用情況下的協(xié)同腫瘤抑制作用。實(shí)施例9重組AFP刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)的用途通過(guò)用0.2％胰蛋白酶溶液處理合法流產(chǎn)后得到的5-10周的胚胎組織獲得肺和人視網(wǎng)膜的胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。細(xì)胞在10％胎牛血清(CFS)的存在下在RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。如早先所述(SemenkovaL.N.，1997，TumorBiol.18，261-274；DudichE.I.，等人，1998，TumorBiol.19，30-40)測(cè)量AFP抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。細(xì)胞以每0.15ml培養(yǎng)基4×104的量用新鮮培養(yǎng)基徹底洗滌并放置在96孔板的每個(gè)孔中，隨后加入不同劑量的AFP并培養(yǎng)24小時(shí)。通過(guò)在培養(yǎng)的最后4小時(shí)內(nèi)摻入[H3]胸腺嘧啶核苷的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量細(xì)胞的增殖。還對(duì)人胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)物進(jìn)行AFP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的劑量依賴效應(yīng)研究。AFP對(duì)這些細(xì)胞具有刺激效應(yīng)，其達(dá)到對(duì)照的50-90％(附圖7)。實(shí)施例10重組AFP在美容學(xué)中的用途考慮到AFP具有刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)的能力并且是胚胎細(xì)胞的生長(zhǎng)因子的事實(shí)，提出其可以用于制備化妝品面膜、乳膏和洗劑。rAFP可以用作脂質(zhì)體、微粒體和納米體(nanosome)的賦形劑?？紤]到AFP能夠結(jié)合疏水性配體的事實(shí)，所述配體特別是脂溶性維生素、類固醇、異黃酮類(isoflavinoid)、多不飽和脂肪酸(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)；AusselC.&MasseyeffR.，1994，Biochem.Biophys.Res.Commun.1191122-1127；DeutschH.F.，1994，J.TumorMarkerOncol.911-14)，顯示了rAFP與脂溶性維生素例如類視黃醇、類胡蘿卜素、tokoferol、維生素D的衍生物，與類固醇例如雌激素和雄激素的衍生物的組合用途。雌二醇及其他也可用作此類類固醇的實(shí)例。REFERENCESAmannE.，OchsB.，AbelK.-J.(1988)TightlyregulatedtacpromotervectorsusefulfortheexpressionofunfusedandfusedproteinsinEscherichiacoli.Gene.69(2)301-15.Aussel，C.&Masseyeff，R.(1994)Interactionofretinoidsandbilirubinwiththebindingofarachidonicacidtohumanalpha-fetoprotein.Biochem.Biophys.Res.Commun.119，1122-1127.Bennett，J.A.，Semeniuk，D.J.，Jacobson，H.I.&Murgita，R.A.(1997)Similaritybetweennaturalandrecombinanthumanalpha-fetoproteinasinhibitorsofestrogen-dependentbreastcancergrowth.BreastCancerRes.Treat.45，169-179Bennet，J.A.，Zhu，S.，Pagano-Mirarchi，A.，Kellom，T.A.&Jacobson，H.I.(1998)α-Fetoproteinderivedfromahumanhepatomapreventsgrowthofestrogen-dependenthumanbreastcancerxenografts.ClinicalCancerResearch，4，2877-2884.BoismenuR.，SemeniukD.，MurgitaR.A.(1997)Purificationandcharacterizationofhumanandmouserecombinantalpha-fetoproteinsexpressedinEcherichiacoli.ProteinExpressionandPurification.1010-26.ChungB.H.，ParkK.S.(1998)AsimpleapproachtoreducingtheproteolysisduringthesecretoryproductionofhumanparathyroidhormoneinSaccharomycescerevisiae.Biotechnol.Bioeng.57245-249.Deutsch，H.F.(1991)Chemistryandbiologyofα-fetoprotein.Adv.Cane.Res.56，253-312.DeutschH.F.(1994)Theuptakeofadriamycin-arachidonicacidcomplexesbyhumantumorcellsinthepresenceofα-fetoprotein.J.TumorMarkerOncol.911-14.Dudich，E.I，Semenkova，L.N.，Gorbatova，E.A.，Dudich，I.V.，Khromykh，L.M.，Tatulov，E.B.，Grechko，G.K.&Sukhikh，G.T.(1998)Growth-regulativeactivityofalpha-fetoproteinfordifferenttypesoftumorandnormalcells.TumorBiol.19，30-40.DudichE.I.，SemenkovaL.N.，DudichLV.，GorbatovaE.A.，Tokhtamysheva，N.，TatulovE.B.，NikolaevaM.A.&SukhikhG.T.(1999)α-Fetoproteincausesapoptosisintumorcellsviaapathwa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agacataactgttttcttgcacacaaaaagcccactccagcatcgatcccactt1140ttccaagttccagaacctgtcacaagctgtgaagcatatgaagaagacagggagacattc1200atgaacaaattcatttatgagatagcaagaaggcatcccttcctgtatgcacctacaatt1260cttctttgggctgctcgctatgacaaaataattccatcttgctgcaaagctgaaaatgca1320gttgaatgcttccaaacaaaggcagcaacagttacaaaagaattaagagaaagcagcttg1380ttaaatcaacatgcatgtgcagtaatgaaaaattttgggacccgaactttccaagccata1440actgttactaaactgagtcagaagtttaccaaagttaattttactgaaatccagaaacta1500gtcctggatgtggcccatgtacatgagcactgttgcagaggagatgtgctggattgtctg1560caggatggggaaaaaatcatgtcctacatatgttctcaacaagacactctgtcaaacaaa1620ataacagaatgctgcaaactgaccacgctggaacgtggtcaatgtataattcatgcagaa1680aatgatgaaaaacctgaaggtctatctccaaatctaaacaggtttttaggagatagagat1740tttaaccaattttcttcaggggaaaaaaatatcttcttggcaagttttgttcatgaatat1800tcaagaagacatcctcagcttgctgtctcagtaattctaagagttgctaaaggataccag1860gagttattggagaagtgtttccagactgaaaaccctcttgaatgccaagataaaggagaa1920gaagaattacagaaatacatccaggagagccaagcattggcaaagcgaagctgcggcctc1980ttccagaaactaggagaatattacttacaaaatgcgtttctcgttgcttacacaaagaaa2040gccccccagctgacctcgtcggagctgatggccatcaccagaaaaatggcagccacagca2100gccacttgttgccaactcagtgaggacaaactattggcctgtggcgagggagcggctgac2160attattatcggacacttatgtatcagacatgaaatgactccagtaaaccctggtgttggc2220cagtgctgcacttcttcatatgccaacaggaggccatgcttcagcagcttggtggtggat2280gaaacatatgtccctcctgcattctctgatgacaagttcattttccataaggatctgtgc2340caagctcagggtgtagcgctgcaaacgatgaagcaagagtttctcattaaccttgtgaag2401caaaagccacaaataacagaggaacaacttgaggctgtcattgcagatttctcaggcctg2460ttggagaaatgctgccaaggccaggaacaggaagtctgctttgctgaagagggacaaaaa2520ctgatttcaaaaactcgtgctgctttgggagtttaa2556<210>2<211>590<212>PRT<213>智人<400>2ThrLeuHisArgAsnGluTyrGlyIleAlaSerIleLeuAspSerTyr151015GlnCysThrAlaGluIleSerLeuAlaAspLeuAlaThrIlePhePhe202530AlaGlnPheValGlnGluAlaThrTyrLysGluValSerLysMetVal354045LysAspAlaLeuThrAlaIleGluLysProThrGlyAspGluGlnSer505560SerGlyCysLeuGluAsnGlnLeuProAlaPheLeuGluGluLeuCys65707580HisGluLysGluIleLeuGluLysTyrGlyHisSerAspCysCysSer859095GlnSerGluGluGlyArgHisAsnCysPheLeuAlaHisLysLysPro100105110ThrProAlaSerIleProLeuPheGlnValProGluProValThrSer115120125CysGluAlaTyrGluGluAspArgGluThrPheMetAsnLysPheIle130135140TyrGluIleAlaArgArgHisProPheLeuTyrAlaProThrIleLeu145150155160LeuTrpAlaAlaAgrTyrAspLysIleIleProSerCysCysLysAla165170175GluAsnAlaValGluCysPheGlnThrLysAlaAlaThrValThrLys180185190GluLeuArgGluSerSerLeuLeuAsnGlnHisAlaCysAlaValMet195200205LysAsnPheGlyThrArgThrPheGlnAlaIleThrValThrLysLeu210215220SerGlnLysPheThrLysValAsnPheThrGluIleGlnLysLeuVal225230235240LeuAspValAlaHisValHisGluHisCysCysArgGlyAspValLeu245250255AspCysLeuGlnAspGlyGluLysIleMetSerTyrIleCysSerGln260265270GlnAspThrLeuSerAsnLysIleThrGluCysCysLysLeuThrThr275280285LeuGluArgGlyGlnCysIleIleHisAlaGluAsnAspGluLysPro290295300GluGlyLeuSerProAsnLeuAsnArgPheLeuGlyAspArgAspPhe305310315320AsnGlnPheSerSerGlyGluLysAsnIlePheLeuAlaSerPheVal325330335HisGluTyrSerArgArgHisProGlnLeuAlaValSerValIleLeu340345350ArgValAlaLysGlyTyrGlnGluLeuLeuGluLysCysPheGlnThr355360365GluAsnProLeuGluCysGlnAspLysGlyGluGluGluLeuGlnLys370375380TyrIleGlnGluSerGlnAlaLeuAlaLysArgSerCysGlyLeuPhe385390395400GlnLysLeuGlyGluTyrTyrLeuGlnAsnAlaPheLeuValAlaTyr405410415ThrLysLysAlaProGlnLeuThrSerSerGluLeuMetAlaIleThr420425430ArgLysMetAlaAlaThrAlaAlaThrCysCysGlnLeuSerGluAsp435440445LysLeuLeuAlaCysGlyGluGlyAlaAlaAspIleIleIleGlyHis450455460LeuCysIleArgHisGluMetThrProValAsnProGlyValGlyGln465470475480CysCysThrSerSerTyrAlaAsnArgArgProCysPheSerSerLeu485490495ValValAspGluThrTyrValProProAlaPheSerAspAspLysPhe500505510IlePheHisLysAspLeuCysGlnAlaGlnGlyValAlaLeuGlnThr515520525MetLysGlnGluPheLeuIleAsnLeuValLysGlnLysProGlnIle530535540ThrGluGluGlnLeuGluAlaValIleAlaAspPheSerGlyLeuLeu545550555560GluLysCysCysGlnGlyGlnGluGlnGluValCysPheAlaGluGlu565570575GlyGlnLysLeuIleSerLysThrArgAlaAlaLeuGlyVal580585590權(quán)利要求1.一種SEQIDNO1的表達(dá)盒，其包括GAL1酵母基因的啟動(dòng)子區(qū)；MFα1酵母基因的分泌前原區(qū)；編碼具有成熟的人甲胎蛋白活性的蛋白質(zhì)的DNA序列，以及CYC1酵母基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)盒，其中編碼具有成熟的人甲胎蛋白活性的蛋白質(zhì)的所述DNA序列是編碼成熟的人甲胎蛋白(SEQIDNO2)或其具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基刪除、添加或置換的修飾形式的合成基因，所述修飾導(dǎo)致形成修飾的人甲胎蛋白，其序列至少80％對(duì)應(yīng)成熟的人甲胎蛋白(SEQIDNO2)的氨基酸序列，在含修飾結(jié)構(gòu)的所述產(chǎn)物中保留了成熟的人甲胎蛋白的功能生物學(xué)活性。3.一種重組的pKX質(zhì)粒，其包括根據(jù)權(quán)利要求1或2的表達(dá)盒；細(xì)菌質(zhì)粒pUC18的片段；2-μm酵母質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)；提供蛋白質(zhì)正確裝配并將所需產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中的KAR2基因；提供二硫鍵正確形成的PD11基因；選擇性的URA3和選擇性的PGK1酵母標(biāo)記。4.一種通過(guò)用根據(jù)權(quán)利要求3的pKX質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的真核生產(chǎn)細(xì)胞，其具有分泌人重組甲胎蛋白的能力。5.一種生產(chǎn)細(xì)胞菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX，其具有分泌人重組甲胎蛋白的能力，被保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，保藏號(hào)為Y-3115。6.一種制備重組甲胎蛋白的方法，所述重組甲胎蛋白具有血清來(lái)源的成熟人甲胎蛋白的生物學(xué)活性，其包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求4的真核細(xì)胞，所述細(xì)胞具有將重組甲胎蛋白分泌到培養(yǎng)基中的能力，以及從所述培養(yǎng)基中分離所述重組甲胎蛋白的步驟。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于酵母細(xì)胞是啤酒糖酵母菌株YBS723/pKX的細(xì)胞，所述菌株被保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，保藏號(hào)為Y-3115，并具有分泌重組甲胎蛋白的能力。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于培養(yǎng)在23-33℃下在培養(yǎng)基中進(jìn)行，所述培養(yǎng)基包括葡萄糖-2％、甘油-1.5％、酵母提取物-1％、蛋白胨-2％、蒸餾水；通過(guò)另外的緩沖作用使培養(yǎng)基的pH維持在4.5-7.0并加入可溶氧至p0＞20％。10.一種根據(jù)權(quán)利要求6的方法制備的重組甲胎蛋白，其具有成熟的人血清AFP的特性，所述特性根據(jù)免疫反應(yīng)及其體外抑制B細(xì)胞Raji淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力在不低于成熟的人血清AFP活性的10％的水平上而進(jìn)行確定。11.一種抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求10的重組甲胎蛋白以及藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑。12.一種抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求10的重組甲胎蛋白和化學(xué)治療制劑以及藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，所述化學(xué)治療制劑例如阿霉素、長(zhǎng)春新堿、氟尿嘧啶、metatrexate、放線菌素D、絲裂霉素C、它莫西芬、氟他胺、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、環(huán)孢菌素C、視黃酸衍生物、類胡蘿卜素、類固醇激素。13.一種治療癌癥或阻止癌癥發(fā)展的方法，其包括對(duì)有此需要的患者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求10的重組甲胎蛋白、根據(jù)權(quán)利要求11的藥物組合物或根據(jù)權(quán)利要求12的協(xié)同組合物。14.一種具有免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)作用的協(xié)同組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求10的重組甲胎蛋白，和環(huán)孢菌素C，以及藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑。15.一種治療自身免疫性疾病并糾正免疫狀態(tài)的方法，其包括對(duì)有此需要的患者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求10的重組甲胎蛋白以及藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑或施用根據(jù)權(quán)利要求14的組合物。16.一種刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物組合物，所述組合物包括根據(jù)權(quán)利要求10的重組甲胎蛋白以及藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑。17.一種刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同組合物，所述組合物包括根據(jù)權(quán)利要求10的重組甲胎蛋白，和維生素A、E、D的衍生物，抗氧化劑，類固醇激素，植物來(lái)源的異黃酮，以及藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑。18.一種在體外刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包括用有效量的根據(jù)權(quán)利要求10的重組甲胎蛋白、根據(jù)權(quán)利要求16的藥物組合物或根據(jù)權(quán)利要求17的協(xié)同組合物作用于細(xì)胞。19.一種在體內(nèi)刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包括對(duì)有此需要的患者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求10的重組甲胎蛋白、根據(jù)權(quán)利要求16的藥物組合物或根據(jù)權(quán)利要求17的協(xié)同組合物。20.一種使皮膚更新并防止皮膚衰老的化妝品組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求10的重組甲胎蛋白，美容學(xué)上可接受的載體和賦形劑，以及任選的維生素A、E、D衍生物，抗氧化劑，類固醇激素，植物來(lái)源的異黃酮。21.一種利用根據(jù)權(quán)利要求20的化妝品組合物使皮膚更新并防止皮膚衰老的方法，其包括在個(gè)體皮膚上應(yīng)用所述組合物。專利摘要本發(fā)明涉及微生物和醫(yī)藥行業(yè)、遺傳工程學(xué)、生物工藝學(xué)。在構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA的基礎(chǔ)上獲得啤酒糖酵母酵母菌株，所述重組質(zhì)粒DNA包括在調(diào)節(jié)啟動(dòng)子控制下的人甲胎蛋白(AFP)的結(jié)構(gòu)基因，所述菌株提供以被分泌的溶解形式合成和生產(chǎn)的AFP，這種AFP具有與人AFP活性相同或相似的活性。所獲得的重組AFP可以用作制備治療劑的活性物質(zhì)，所述治療劑用于腫瘤學(xué)、免疫治療、美容學(xué)并且還用于癌癥和胚胎病理診斷。文檔編號(hào)C12N15/12GK1993469SQ20058002616公開(kāi)日2007年7月4日申請(qǐng)日期2005年7月7日發(fā)明者S·V·別涅沃連斯基,A·N·馬爾琴科,D·G·科茲洛夫,S·S·扎采平,L·N·辛加洛娃,I·V·杜迪奇,L·N·謝冕科娃,D·I·杜迪奇,E·B·塔圖洛夫,E·I·杜迪奇申請(qǐng)人:生物系統(tǒng)股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan