本發(fā)明屬于基因診斷和人類輔助生殖領(lǐng)域，具體而言，涉及胚胎植入前診斷技術(shù)(PGD)，是一種能夠鑒別胚胎是否攜帶親本平衡易位染色體遺傳信息的單體型連鎖分析方法。
背景技術(shù)：
：染色體平衡易位是一種常見的染色體結(jié)構(gòu)變異，是由于不同染色體的斷裂部分發(fā)生錯誤拼接而造成的染色體異常。正常人群中大概有0.19％的發(fā)生率，在反復(fù)流產(chǎn)或者反復(fù)IVF種植失敗的患者中發(fā)生的概率約為5％。盡管平衡易位攜帶者一般情況無異常表型，但是其原始生殖細(xì)胞減數(shù)分裂產(chǎn)生的配子中有高達(dá)19％-77％為不平衡型的配子，這與染色體易位的斷裂點和發(fā)生易位的具體染色體有關(guān)。染色體的四價體結(jié)構(gòu)，通常發(fā)生在細(xì)胞減數(shù)分裂I期，由易位的兩條染色體和與其對應(yīng)的兩條正常的同源染色體配對產(chǎn)生。這種四價結(jié)構(gòu)通常的形式有2:2，3:1或者4:0三種分離模式。只有在2:2的模式下，對位分離模式能產(chǎn)生正常或者平衡的配子，其他的分離模式均產(chǎn)生非平衡類型的配子。非平衡的配子會導(dǎo)致不孕，反復(fù)流產(chǎn)，或者生育智力障礙或其他先天異常的后代。PGD即“胚胎移植入診斷技術(shù)”最早由HandysideAH首先成功應(yīng)用于臨床，最初的PGD技術(shù)使用PCR或FISH方法檢測性別，幫助有風(fēng)險生育血友病A、進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良等X連鎖遺傳病后代的夫婦妊娠分娩出正常女嬰；2006年來，有研究者通過選擇與致病基因在染色體的位置上緊密連鎖的STR標(biāo)記位點來診斷胚胎是否遺傳了致病基因，進(jìn)行單基因疾病的胚胎植入前診斷，該方法又被稱為植入前遺傳學(xué)單倍型分析(preimplantationgenetichaplotyping，PGH)。PGD技術(shù)由于可以在染色體平衡易位的患者中篩查出沒有染色體大片段異常的健康胚胎，提高臨床妊娠率，在輔助生殖領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。對于具有已知的染色體平衡易位的夫婦，基于熒光原位雜交(FISH)的PGD最早用來篩選出不平衡的胚胎，但是由于FISH技術(shù)在細(xì)胞固定和信號讀取方面的技術(shù)限制，會影響結(jié)果解讀的精確性。近年來，基因芯片技術(shù)和測序技術(shù)由于其能對23對染色體全面進(jìn)行篩查的優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于各個生殖中心，提高了臨床妊娠率。但是盡管如此，這些傳統(tǒng)的PGD技術(shù)只能對胚胎的拷貝數(shù)變異進(jìn)行檢測。到目前，已有一些關(guān)于鑒別染色體平衡易位攜帶胚胎和完全正常胚胎的文章報道。最初，研究者針對染色體易位斷裂點設(shè)計特跨斷裂點的特異性FISH探針，可用于區(qū)別染色體正常和平衡易位的胚胎，雖然該方法有一定的可行性，但方法設(shè)計復(fù)雜、耗時很難在臨床工作中得到應(yīng)用。近期，Treff等人的研究則采用了基于SNP芯片技術(shù)，以易位攜帶者夫婦雙方和不平衡胚胎為參照，通過構(gòu)建斷裂點5Mb之內(nèi)的單體型進(jìn)行鑒別，可以鑒定染色體相互易位的攜帶者胚胎的染色體狀況。另有研究小組發(fā)明了一種MicroSeq-PGD的技術(shù)，通過結(jié)合染色體易位斷裂點顯微切割技術(shù)和NGS，檢測出易位斷裂點附近的DNA的序列，從而區(qū)別正常的胚胎和平衡易位的胚胎。但是，上述方法都存在下述缺陷：1)方法技術(shù)流程都非常復(fù)雜，耗時較長；2)無法判斷斷裂點區(qū)域的同源重組情況；3)不適用于羅伯遜易位的攜帶者?？梢?，現(xiàn)有技術(shù)中仍然缺乏能夠準(zhǔn)確、快速應(yīng)用于臨床的鑒別染色體平衡易位(相互易位和羅伯遜易位)胚胎的輔助生殖技術(shù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明建立了一種基于全基因組大規(guī)模SNP基因分型結(jié)果進(jìn)行胚胎植入前單體型分析(PGH)的方法。根據(jù)本發(fā)明所述方法，針對染色體平衡易位(包括相互易位和羅伯遜易位)的患者及其配偶、體外授精后的胚胎和易位攜帶者親屬的染色體進(jìn)行家系單體型連鎖分析，能快速、簡便、準(zhǔn)確地區(qū)分出染色體平衡易位的胚胎和染色體正常的胚胎，并同時對胚胎的染色體拷貝數(shù)變異進(jìn)行篩查，提高臨床妊娠率，能夠在體外受精的胚胎植入前及時區(qū)分?jǐn)y帶平衡易位染色體的胚胎和正常染色體的胚胎，從而優(yōu)先移植染色體完全正常的胚胎，及時阻斷染色體平衡易位遺傳給下一代。一定程度上推動了人類輔助生殖技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了一種用于鑒別染色體平衡易位攜帶胚胎和染色體完全正常胚胎的家系單體型構(gòu)建方法，包含以下步驟：1)樣本基因分型：將染色體平衡易位攜帶者夫婦雙方、至少一名攜帶者親屬和染色體平衡易位攜帶者夫婦體外受精胚胎進(jìn)行大規(guī)模SNP基因型檢測；攜帶者親屬可為與攜帶者具有相同平衡易位的親屬，也可為染色體正常的親屬；2)確定信息SNPs位點：信息SNPs的選擇標(biāo)準(zhǔn)為：在染色體平衡易位攜帶者中為雜合型，在其配偶中為純合型，并且在攜帶者親屬中也是純合型的SNP位點；選擇覆蓋染色體易位斷裂點、易位染色體和與其相對應(yīng)的正常的同源染色體上的信息SNPs，染色體每Mb范圍內(nèi)至少選擇1個信息SNP；在覆蓋斷裂點區(qū)域，信息SNPs從斷裂點上下游1‐5Mb范圍內(nèi)選擇；3)構(gòu)建家系單體型：集合步驟2)確定的信息SNPs位點通過家系連鎖分析得到覆蓋兩處斷裂區(qū)域、易位染色體整條染色體及其同源染色體的整條染色體的單體型，不同染色體單體型的集合稱為家系單體型。本發(fā)明提供了一種鑒別染色體平衡易位攜帶胚胎和染色體完全正常胚胎的PGH方法，包含以下步驟：1)樣本基因分型將染色體平衡易位攜帶者夫婦雙方、至少一名攜帶者親屬和攜帶者夫婦體外受精胚胎進(jìn)行大規(guī)模SNP基因型檢測；攜帶者親屬可為與攜帶者具有相同平衡易位的親屬，也可為染色體正常的親屬；將染色體平衡易位攜帶者夫婦雙方、攜帶者親屬稱為參照樣本，攜帶者夫婦體外受精胚胎稱為待定樣本；2)確定信息SNPs位點信息SNPs的選擇標(biāo)準(zhǔn)為：在染色體平衡易位攜帶者中為雜合型，在其配偶中為純合型，并且在攜帶者親屬中也是純合型的SNP位點；選擇覆蓋染色體易位斷裂點、易位染色體和與其相對應(yīng)的正常的同源染色體上的信息SNPs，染色體每Mb范圍內(nèi)至少選擇1個信息SNP；在覆蓋染色體易位斷裂點區(qū)域，信息SNPs從染色體易位斷裂點上下游1‐5Mb范圍內(nèi)選擇；3)構(gòu)建家系單體型集合步驟2)確定的信息SNPs位點通過家系連鎖分析得到覆蓋兩處斷裂區(qū)域、易位染色體整條染色體及其同源染色體的整條染色體的單體型，不同染色體單體型的集合稱為家系單體型；4)數(shù)據(jù)收集和分析將待定樣本中染色體易位斷裂點區(qū)域的單體型信息和參照樣本的染色體單體型信息進(jìn)行比對，通過整條染色體的單體型判斷染色體易位斷裂點區(qū)域是否發(fā)生了同源重組：i)當(dāng)以與攜帶者具有相同平衡易位的親屬為參照時：a.若待定樣本染色體易位斷裂點區(qū)域沒有發(fā)生重組，當(dāng)待定樣本斷裂點區(qū)域單體型信息和參照樣本中染色體平衡易位攜帶者以及與攜帶者具有相同平衡易位的親屬的單體型信息一致時，則為平衡易位攜帶胚胎；當(dāng)待定樣本斷裂點區(qū)域單體型信息與參照樣本中染色體平衡易位攜帶者單體型信息一致，但與攜帶者具有相同平衡易位的親屬的單體型信息不一致時，則為染色體完全正常的胚胎；b.若待定樣本染色體易位斷裂點區(qū)域發(fā)生了同源重組，則平衡易位攜帶或染色體完全正常胚胎的判斷標(biāo)準(zhǔn)與a相反；ii)當(dāng)以染色體正常的親屬為參照時：a.若待定樣本染色體易位斷裂點區(qū)域沒有發(fā)生重組，當(dāng)待定樣本斷裂點區(qū)域單體型信息和參照樣本中染色體平衡易位攜帶者以及與攜帶者的染色體正常的親屬的單體型信息一致時，則為染色體完全正常的胚胎；當(dāng)待定樣本斷裂點區(qū)域單體型信息與參照樣本中染色體平衡易位攜帶者單體型信息一致，但與攜帶者的染色體正常的親屬的單體型信息不一致時，則為平衡易位攜帶胚胎；b.若待定樣本染色體易位斷裂點區(qū)域發(fā)生了同源重組，則平衡易位攜帶或染色體完全正常胚胎的判斷標(biāo)準(zhǔn)與a相反。本發(fā)明所述大規(guī)模SNP基因型檢測覆蓋23對染色體；大規(guī)模SNP基因型檢測方法優(yōu)選基因芯片和基因測序。本發(fā)明選擇胚胎發(fā)育至第3‐7天時，活檢獲取1‐10個細(xì)胞作為步驟1)中所述體外受精胚胎的檢測樣本；優(yōu)選來源于胚胎卵裂球活檢或囊胚滋養(yǎng)外胚層活檢的細(xì)胞。本發(fā)明信息SNPs位點在覆蓋染色體易位斷裂點區(qū)域時，所述信息SNPs從斷裂點上下游2‐4Mb范圍內(nèi)選擇，優(yōu)選從斷裂點上下游2Mb范圍內(nèi)選擇。本發(fā)明構(gòu)建家系單體型時，每條染色體每Mb范圍內(nèi)至少選擇2、3、4、5、6、7、8、9或10個信息SNPs。本發(fā)明將活檢獲取的細(xì)胞裂解，進(jìn)行全基因組擴(kuò)增；全基因組擴(kuò)增方法可選自MDA方法、MALBAC方法、或其他全基因組擴(kuò)增方法。本發(fā)明染色體平衡易位攜帶者夫婦雙方與攜帶者親屬的檢測樣本的來源為體細(xì)胞，優(yōu)選外周血。本發(fā)明提供了一種用于鑒別染色體平衡易位攜帶胚胎的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含能夠計算處理樣本數(shù)據(jù)的軟件、和用于承載上述軟件的硬件，其特征在于，1)所述系統(tǒng)還包含儲存有染色體平衡易位攜帶者夫婦雙方、至少一名攜帶者親屬和染色體平衡易位攜帶者夫婦體外受精胚胎進(jìn)行大規(guī)模SNP基因型檢測的基因分型數(shù)據(jù)的硬件；攜帶者親屬可為與攜帶者具有相同平衡易位的親屬，也可為染色體正常的親屬；將染色體平衡易位攜帶者夫婦雙方、攜帶者親屬稱為參照樣本，攜帶者夫婦體外受精胚胎稱為待定樣本；2)所述軟件根據(jù)下述規(guī)則確定信息SNPs位點：信息SNPs的選擇標(biāo)準(zhǔn)為：在染色體平衡易位攜帶者中為雜合型，在其配偶中為純合型，并且在攜帶者親屬中也是純合型的SNP位點；選擇覆蓋染色體易位斷裂點、易位染色體和與其相對應(yīng)的正常的同源染色體上的信息SNPs，染色體每Mb范圍內(nèi)至少選擇1個信息SNP；在覆蓋斷裂點區(qū)域，信息SNPs從斷裂點上下游1‐5Mb范圍內(nèi)選擇；3)所述軟件依照下述原則構(gòu)建家系單體型：每條染色體上依照上述標(biāo)準(zhǔn)選取的信息SNPs位點，通過家系連鎖分析得到覆蓋兩處斷裂區(qū)域、易位染色體整條染色體及其同源染色體的整條染色體的單體型，不同染色體單體型的集合稱為家系單體型；4)所述軟件將待定樣本中染色體易位斷裂點區(qū)域的單體型信息和參照樣本的染色體單體型信息進(jìn)行比對，通過整條染色體的單體型判斷染色體易位斷裂點區(qū)域是否發(fā)生了同源重組：i)當(dāng)以與攜帶者具有相同平衡易位的親屬為參照時：a.若待定樣本染色體易位斷裂點區(qū)域沒有發(fā)生重組，當(dāng)待定樣本斷裂點區(qū)域單體型信息和參照樣本中染色體平衡易位攜帶者以及與攜帶者具有相同平衡易位的親屬的單體型信息一致時，則為平衡易位攜帶胚胎；當(dāng)待定樣本斷裂點區(qū)域單體型信息與參照樣本中染色體平衡易位攜帶者單體型信息一致，但與攜帶相同平衡易位的攜帶者親屬的單體型信息不一致時，則為染色體完全正常的胚胎；b.若待定樣本染色體易位斷裂點區(qū)域發(fā)生了同源重組，則平衡易位攜帶或染色體完全正常胚胎的判斷標(biāo)準(zhǔn)與a相反；ii)當(dāng)以染色體正常的親屬為參照時：a.若待定樣本染色體易位斷裂點區(qū)域沒有發(fā)生重組，當(dāng)待定樣本斷裂點區(qū)域單體型信息和參照樣本中染色體平衡易位攜帶者以及與攜帶者的染色體正常的親屬的單體型信息一致時，則為染色體完全正常的胚胎；當(dāng)待定樣本斷裂點區(qū)域單體型信息與參照樣本中染色體平衡易位攜帶者單體型信息一致，但與攜帶者的染色體正常的親屬的單體型信息不一致時，則為平衡易位攜帶胚胎；b.若待定樣本染色體易位斷裂點區(qū)域發(fā)生了同源重組，則平衡易位攜帶或染色體完全正常胚胎的判斷標(biāo)準(zhǔn)與a相反。本發(fā)明所述鑒別染色體平衡易位攜帶胚胎和染色體完全正常胚胎的PGH方法具有如下優(yōu)勢：1)可以對胚胎中染色體狀態(tài)進(jìn)行預(yù)測的同時，對23對染色體的進(jìn)行篩查；2)除了斷裂點區(qū)域的單體型，可以同時建立涉及易位的整條染色體和對應(yīng)的正常同源染色體的整條染色體的單體型，這可以顯示病人的兩條同源染色體在斷裂點區(qū)域的重組情況，PGH的預(yù)測可以包含斷點區(qū)域到整個染色體；3)適用于所有遺傳性的染色體平衡易位家系(包括相互易位和羅伯遜易位)；4)方法相對簡單，需時較短，整個鑒別過程可以在48h內(nèi)完成，適用于常規(guī)臨床工作。附圖說明圖1.攜帶染色體平衡易位的家系圖譜示意圖2.3號家系外周血核型圖圖3.3號家系單體型圖具體實施方式實施例1：患者及患者親代的參照樣本收集募集了9個將接受輔助生殖的染色體平衡易位攜帶家庭，入選者均來自上海集愛遺傳與輔助生殖研究所。每個家庭都需要簽署書面知情同意書，研究方案由復(fù)旦大學(xué)婦產(chǎn)科醫(yī)院人類受試者倫理委員會批準(zhǔn)。從2014年6月到2016年3月，所有9個家庭都有復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)史或者染色體異常的歷史，染色體平衡易位攜帶的夫婦一方在后文中簡稱為“患者”，另一方簡稱“患者配偶”，攜帶染色體平衡易位的家系圖譜示意請見圖1。在募集的同時抽取每對患者夫婦和患者親屬(患者父母優(yōu)先考慮，也可為其他親屬)的外周血10ml。一部分外周血用于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行染色體核型分析；另一部分外周血按照本領(lǐng)域常規(guī)方式提取DNA，已備后續(xù)SNPs分型使用。外周血染色體制備方法如下：1、細(xì)胞培養(yǎng)1).采血：酒精消毒皮膚，肘靜脈采血，將注射針直接穿過培養(yǎng)瓶的橡膠塞，向10ml培養(yǎng)基中注入30-40滴全血，輕搖勻后置37℃恒溫箱培養(yǎng)。2).培養(yǎng)：時間為68小時。培養(yǎng)期間，定期輕搖勻，使細(xì)胞充分接觸培養(yǎng)基。3).秋水仙素處理：終止培養(yǎng)前2-4小時，在培養(yǎng)液中加入秋水仙堿(用1ml注射器5號針尖滴加2滴，使終濃度為0.07μg/ml)。以上步驟均需無菌操作2、染色體制備1).收集細(xì)胞：將培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入潔凈離心管中，以1000rpm離心8-10分鐘，棄上清液。2).低滲處理：向刻度離心管中加入預(yù)溫37℃的低滲液8ml，用滴管混勻，置37℃恒溫水浴中低滲15-25分鐘。3).預(yù)固定：低滲后加入0.5ml固定液，輕輕混勻后1000rpm離心8-10分鐘。4).一固定：棄上清液，加入5ml固定液，輕輕混勻，靜置20分鐘。1000rpm離心，棄上清液。5).二固定、三固定：同一固定。6).制懸液：棄上清液后，視細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液制成細(xì)胞懸液。7).滴片：吸取細(xì)胞懸液自10-20cm高滴在一張干燥潔凈的載玻片上，輕吹散，氣干。8).染色：1:10Giemsa染色5-10分鐘，細(xì)水洗去多余染液，氣干。9).鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，油鏡下觀察染色體形態(tài)并計數(shù)。如果患者的外周血細(xì)胞核型與其母親相同，則患者的平衡易位遺傳自母方；與父親相同，則患者的平衡易位遺傳自父親。當(dāng)患者父母無法取血(如去逝)或不同意取血時，患者的兄弟姐妹或其他親屬也可取外周血做核型分析，也可以作為構(gòu)建家系單體型時的參照樣本。1-9號家系的易位染色體核型請見表1。圖2展示了3號家系的外周血核型圖。表1.1-9號家系易位染色體核型表家系編號染色體數(shù)目攜帶者易位染色體核型146XYt(5；22)(q33；q12)mat246XXt(16；18)(q22；q21.1)pat346XXt(12；22)(p12；q13)pat446XXt(11；16)(p11.2；p12.3)pat546XYt(1；19)(q12；p13)mat645XXrob(14；21)(q10；q10)mat745XYrob(14；21)(q10；q10)pat845XXrob(14；15)(q10；q10)pat946XYt(6；9)(q27；q22)mat/pat實施例2：囊胚活檢和全基因組擴(kuò)增(WGA)1、體外受精對募集的9個家庭進(jìn)行體外受精(IVF)，體外受精方法遵循本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行；這些家庭的母本/父本年齡、表型，排卵結(jié)果、受精卵數(shù)量和最終用于活檢的囊胚數(shù)量列于表2。通過上述體外受精，9個家庭共獲得44個囊胚進(jìn)行后續(xù)的活檢和單體型分析研究。表2.1-9號家系基本情況和體外受精情況2、囊胚活檢及全基因組擴(kuò)增取上述處于囊胚階段的胚胎，在胚胎發(fā)育的第5或6天從滋養(yǎng)外胚層中移出3至10個細(xì)胞。將活檢細(xì)胞置于裝有堿性變性緩沖液(KOH)的PCR管中進(jìn)行細(xì)胞裂解。再通過多重置換擴(kuò)增(MDA)方法進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(WGA)。依照試劑盒說明書中所述方法，用phi29DNA聚合酶進(jìn)行等溫DNA擴(kuò)增(Repli-g單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒，QIAGENGmbH，Hilden，Germany)，具體操作流程如下：1)預(yù)處理：BufferDLB重懸BufferDLB加入500μlH2Osc混勻離心保存于–20℃，6個月；2)bufferD2配制DTT，1M3μlBufferDLB(reconstituted)33μlTotalvolume36μlBufferD2凍存于–20℃不超過3個月；3)取4μl活檢細(xì)胞裂解樣品與3μlbufferD2混勻，65℃反應(yīng)10min；4)在步驟3)反應(yīng)液中加入3μl終止液終止反應(yīng)；5)Mastermix配制6)在步驟4)獲得的每個反應(yīng)中加入40μlMastermix，總反應(yīng)體系共50μl；7)將步驟6)所述反應(yīng)體系置于30℃反應(yīng)8h，65℃、3min終止反應(yīng)；8)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-20℃保存。實施例3：SNP基因型分型和單體型(haplotypes)分析1、SNP基因型檢測使用IlluminahumanKaryomap-12V1.0微陣列進(jìn)行SNP基因型檢測。每個Karyomap-12芯片包含近300,000個SNPs，可全面覆蓋人23對染色體。將實施例2中進(jìn)行囊胚活檢和全基因組擴(kuò)增獲得的44個樣本按照家系分組，分別與該家系患者夫婦、患者親屬的全基因組擴(kuò)增樣本3份編為一組，進(jìn)行微陣列SNP基因型檢測和分析，分組情況如表3所示。具體實驗方法參照說明書進(jìn)行，在此不再贅述。表3.1-9號家系SNP陣列實驗分組注：F代表女性，M代表男性2、單體型分析獲得芯片檢測的全部SNPs信息后，構(gòu)建胚胎分子核型和家系單體型，分別用于鑒定胚胎染色體拷貝數(shù)狀況和鑒別胚胎染色體平衡易位攜帶狀態(tài)。具體操作方法如下：A.家系單體型構(gòu)建：1)樣本基因分型：將患者夫婦雙方、患者親屬、和胚胎(囊胚)進(jìn)行SNP基因分型；2)確定信息SNPs位點：信息SNPs的選擇標(biāo)準(zhǔn)為：在染色體平衡易位攜帶者中為雜合型，在其配偶中為純合型，并且在患者親屬中也是純合型的SNP位點；選擇覆蓋染色體易位斷裂點、易位染色體和與其相對應(yīng)的正常的同源染色體上的信息SNPs，染色體每Mb范圍內(nèi)至少選擇1個信息SNP；在覆蓋斷裂點區(qū)域，信息SNPs從斷裂點上下游2Mb范圍內(nèi)選擇；3)構(gòu)建家系單體型：集合步驟2)確定的信息SNPs位點通過家系連鎖分析得到覆蓋兩處斷裂區(qū)域、易位染色體整條染色體及其同源染色體的整條染色體的單體型，不同染色體單體型的集合稱為家系單體型。1-9號家系部分胚胎家系單體型構(gòu)建信息如表4所示，圖3展示了3號家系的家系單體型圖：表4.1-9號家系部分胚胎家系單體型構(gòu)建信息1斷裂點通過不平衡胚胎的分子核型確定2患者的哥哥作為參照3患者的姐姐作為參照4因為該處缺少信息SNPs，所以該區(qū)域不能構(gòu)建單體型B.區(qū)分?jǐn)y帶平衡易位或正常染色體的胚胎的方法：將胚胎(囊胚)細(xì)胞中斷裂點區(qū)域的單體型信息和參照樣本的染色體單體型信息進(jìn)行比對，通過整條染色體的單體型信息判斷染色體易位斷裂點區(qū)域是否發(fā)生了同源重組：i)當(dāng)以與攜帶者具有相同平衡易位的親屬為參照時：a.若待定樣本染色體易位斷裂點區(qū)域沒有發(fā)生重組，當(dāng)待定樣本斷裂點區(qū)域單體型信息和參照樣本中染色體平衡易位攜帶者以及與攜帶者具有相同平衡易位的親屬的單體型信息一致時，則為平衡易位攜帶胚胎；當(dāng)待定樣本斷裂點區(qū)域單體型信息與參照樣本中染色體平衡易位攜帶者單體型信息一致，但與攜帶相同平衡易位的攜帶者親屬的單體型信息不一致時，則為染色體完全正常的胚胎；b.若待定樣本染色體易位斷裂點區(qū)域發(fā)生了同源重組，則平衡易位攜帶或染色體完全正常胚胎的判斷標(biāo)準(zhǔn)與a相反；ii)當(dāng)以染色體正常的親屬為參照時：a.若待定樣本染色體易位斷裂點區(qū)域沒有發(fā)生重組，當(dāng)待定樣本斷裂點區(qū)域單體型信息和參照樣本中染色體平衡易位攜帶者以及攜帶者的染色體正常的親屬的單體型信息一致時，則為染色體完全正常的胚胎，當(dāng)待定樣本斷裂點區(qū)域單體型信息與參照樣本中染色體平衡易位攜帶者單體型信息一致，但與攜帶者的染色體正常的親屬的單體型信息不一致時，則為平衡易位攜帶胚胎；b.若待定樣本染色體易位斷裂點區(qū)域發(fā)生了同源重組，則平衡易位攜帶或染色體完全正常胚胎的判斷標(biāo)準(zhǔn)與a相反。3、1-9號家系胚胎染色體平衡易位篩查結(jié)果經(jīng)過家系單體型連鎖分析，對44個待移植胚胎進(jìn)行診斷，20個是平衡易位或者正常的染色體的整倍體，11個是易位相關(guān)的變異，13個顯示和易位無關(guān)的變異；分別使用與攜帶者具有相同平衡易位的親屬或攜帶者的染色體正常的親屬為參照，分析上述20例平衡易位或者正常胚胎，采用上述Bi)或Bii)所述的區(qū)分方法分別對每個胚胎進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果一致：9例是染色體易位胚胎，其余的12例是完全正常胚胎。并且每個胚胎不同易位斷裂點區(qū)域的預(yù)測結(jié)果之間具有一致性。實施例4：胚胎移植及胚胎染色體平衡易位單體型篩查方法效果驗證1、胚胎移植按照本領(lǐng)域常規(guī)方法將上述實施例3表4中涉及的胚胎用于胚胎移植。9個冷凍囊胚融化后均成活，一共經(jīng)過了9個移植周期，均在第一次移植后成功受孕。2、妊娠中期行羊水穿刺進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析驗證胚胎移植成功后，通過與妊娠中期常規(guī)羊水核型的比較來驗證本發(fā)明所述鑒別染色體平衡易位攜帶胚胎和染色體完全正常胚胎的PGH方法的預(yù)測準(zhǔn)確性。羊水細(xì)胞染色體制備方法(原位法)A.細(xì)胞培養(yǎng)1).將羊水(約20ml)轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，1000rpm離心10分鐘；2).去除上清液，用于其它分析，保留細(xì)胞懸液約0.5～1ml，用培養(yǎng)基混勻到2～2.5ml左右；3).將細(xì)胞懸液平分到2～4只Chromslide培養(yǎng)皿中；4).培養(yǎng)24/48小時后，向每只Chromslide培養(yǎng)皿中加入約2.5ml羊水培養(yǎng)基；5).培養(yǎng)第5～6天后，對細(xì)胞生長狀況進(jìn)行觀察，更換新的培養(yǎng)基；6).1～2天后觀察細(xì)胞的生長狀況，如果細(xì)胞克隆數(shù)足夠，向培養(yǎng)皿中加入秋水仙素，收獲細(xì)胞，處理時間根據(jù)秋水溶液濃度確定。B.染色體制備1).傾斜Chromslide細(xì)胞培養(yǎng)皿，完全去除培養(yǎng)基；2).加入3～4ml低滲液到每個培養(yǎng)皿中，室溫處理10分鐘；3).直接向低滲液中加入0.5～0.7ml固定液，室溫處理5分鐘；4).去除上清液，加入3～4ml新鮮的固定液，室溫處理；5).重復(fù)第四步1～2次；6).去除固定液，在Maxchrome染色體分散儀(設(shè)定適當(dāng)?shù)膮?shù))中進(jìn)行染色體分散過程；7).玻片干燥后，老化，顯帶。表5顯示了已成功移植的胚胎中使用本發(fā)明所述鑒別染色體平衡易位攜帶胚胎或染色體正常胚胎方法所獲得的診斷結(jié)果與羊水穿刺進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析驗證的結(jié)果的具體信息。表5.PGH預(yù)測結(jié)果與羊水穿刺細(xì)胞遺傳學(xué)驗證結(jié)果對比由表5可知，經(jīng)過驗證，家系單體型的預(yù)測結(jié)果和羊水穿刺術(shù)中細(xì)胞的遺傳學(xué)分析結(jié)果完全一致，證明本發(fā)明所述鑒別染色體平衡易位攜帶胚胎或正常胚胎的PGH方法的靈敏度和特異性均為100％。當(dāng)前第1頁1 2 3