本發(fā)明涉及藥物代謝動力學(xué)、藥理學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、數(shù)學(xué)建模法等多個領(lǐng)域，創(chuàng)新性地建立了一種基于三維細(xì)胞模型的藥物穿透動力學(xué)評價方法，可半定量描述抗腫瘤藥物在實體瘤內(nèi)的穿透及累積動力學(xué)行為，實現(xiàn)基于體外實驗結(jié)果對在體實驗結(jié)果的預(yù)測，并將其應(yīng)用于小分子抗腫瘤藥物阿霉素及白蛋白結(jié)合的大分子前藥inno-206，為抗腫瘤藥物在瘤內(nèi)穿透的評價及抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了一種合理可靠的新方法。

背景技術(shù)：

隨著臨床需求的加劇及腫瘤生物學(xué)研究的高速發(fā)展，大量基于新的作用機制、作用靶點的抗腫瘤候選化合物及納米制劑等不斷涌現(xiàn)，但于此同時卻伴隨著臨床失敗率顯著增加，藥物研發(fā)成本大幅提升等問題。造成這一問題的原因眾多，其中體外單層細(xì)胞模型無法描述腫瘤微環(huán)境及腫瘤組織的異源性，以及對抗腫瘤藥物在腫瘤內(nèi)穿透過程的忽略是導(dǎo)致抗腫瘤藥物從體外研究向體內(nèi)轉(zhuǎn)化失敗的主要原因，同時也是影響臨床前藥物評價準(zhǔn)確性的重要因素。

為了更好地在體外模擬在體腫瘤的生理生化狀態(tài)并滿足抗腫瘤藥物篩選高通量的要求，腫瘤3d球體細(xì)胞(multicellulartumorspheriod，mcts)模型應(yīng)用而生，其是腫瘤單細(xì)胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)聚集形成的，類似腫瘤小結(jié)節(jié)的三維結(jié)構(gòu)細(xì)胞團塊，在抗腫瘤藥物高通量篩選、腫瘤新生血管生成、腫瘤干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)等方面均有應(yīng)用。近年來，腫瘤3d球體細(xì)胞也被廣泛應(yīng)用于納米制劑腫瘤內(nèi)分布的評價。但這一評價方式卻始終處于現(xiàn)象描述的階段，且存在較多的局限性：(1)無法準(zhǔn)確表征在體實驗結(jié)果：youj等發(fā)現(xiàn)磁性納米粒子在球體細(xì)胞內(nèi)的穿透及累積隨粒徑的增大而逐漸減弱，而體內(nèi)結(jié)果卻呈現(xiàn)相反的趨勢，造成這一現(xiàn)象的原因是因為體外球體細(xì)胞實驗過程中藥物暴露量始終保持恒定過量的狀態(tài)，進(jìn)而忽視了其在體內(nèi)血循環(huán)中的代謝處置過程，而這一問題也是造成體外實驗與體內(nèi)實驗不相關(guān)的重要因素；(2)現(xiàn)有評價方式的重復(fù)性及普適性較差：小分子藥物阿霉素在直徑為250μm的球體細(xì)胞中穿透能力因細(xì)胞系的不同而異，其在250sh-sy5y-mcts中經(jīng)阿霉素給藥8小時后，阿霉素可穿透至距外周50％處，而對于bcg-823-mcts而言，其僅穿透至距外周10％處，結(jié)果提示同種藥物在不同細(xì)胞系培養(yǎng)的球體模型中穿透能力不同，此外，有文獻(xiàn)報道指出藥物的穿透能力隨球體細(xì)胞模型直徑的增大而減弱，而由球體細(xì)胞模型向在體腫瘤模型轉(zhuǎn)化的過程中，藥物需穿透的總距離及腫瘤自身理化性質(zhì)是兩個極為重要的變化參數(shù)，若無法闡明藥物穿透能力的直接影響因素，定量化評價各因素與穿透能力之間的相互關(guān)系，藥物穿透動力學(xué)評價的應(yīng)用性及普適性將會受到極大的限制，同時降低其體外-體內(nèi)轉(zhuǎn)化的準(zhǔn)確性。

由此可見，抗腫瘤藥物的穿透行為是一個包含空間及時間變化的復(fù)雜的動力學(xué)過程，也是連接血漿藥時變化及腫瘤細(xì)胞攝取動力學(xué)的鏈接環(huán)節(jié)，僅基于三維球體細(xì)胞模型的動力學(xué)評價無法準(zhǔn)確描述藥物在腫瘤內(nèi)的實際情況。為了解決這一問題，近年來，陸續(xù)有文獻(xiàn)報道利用數(shù)學(xué)模型來模擬三維球體細(xì)胞模型無法表征的部分，并進(jìn)一步分析影響抗腫瘤藥物穿透行為的影響因素。一般而言，抗腫瘤藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)穿透及累積主要分為三個階段：藥物進(jìn)入組織的暴露量(來源)、藥物在組織內(nèi)的行進(jìn)過程(穿透及累積)、及藥物離開組織的含量(藥物的消除)。而這三個階段受到多種因素的影響，現(xiàn)有的數(shù)學(xué)模型從藥物的經(jīng)時過程分類對以下幾個層面的影響進(jìn)行了模擬及分析：(1)計算機模擬隨機腫瘤血管分布，揭示血管的分布對藥物穿透能力的影響；(2)結(jié)合納米制劑體外動力學(xué)參數(shù)，模擬納米制劑的藥物釋放及活化行為對藥物穿透能力的影響；(3)從腫瘤微環(huán)境及細(xì)胞狀態(tài)異源性入手，探究小分子藥物在腫瘤不同區(qū)域的處置行為差異；(4)以流體動力學(xué)為基礎(chǔ)，探究組織滲透壓及組織間基質(zhì)對藥物穿透的影響等。但由于數(shù)學(xué)模型在藥物穿透動力學(xué)中的應(yīng)用尚處于方興未艾的階段，故現(xiàn)有模型對藥物動力學(xué)行為的描述的整合度不高，尚未有模型能較好地描述抗腫瘤藥物從藥物在腫瘤組織外暴露、到藥物在腫瘤組織間穿透及不同區(qū)域腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取、再到抗腫瘤藥物從組織中消除這一完整的過程，因此，現(xiàn)有模型尚不能準(zhǔn)確地從體外實驗結(jié)果預(yù)測、分析在體腫瘤內(nèi)的分布狀況。而正如前文所述，抗腫瘤藥物的瘤內(nèi)穿透是一個復(fù)雜過程，影響因素眾多，單純的用一個模型去完成描述可能會造成參數(shù)過多、計算繁雜、多變量無法確定等問題。因此，如何根據(jù)生物學(xué)實驗需求，盡可能整合關(guān)鍵環(huán)節(jié)并簡化計算過程是利用數(shù)學(xué)模型解決藥物穿透動力學(xué)的關(guān)鍵。

本專利以三維球體細(xì)胞模型為基礎(chǔ)，根據(jù)腫瘤微環(huán)境變化及異源性的特征，引入描述抗腫瘤藥物在腫瘤不同區(qū)域細(xì)胞間擴散行為的參數(shù)，并以不同區(qū)域的細(xì)胞為單位，在細(xì)胞動力學(xué)的基礎(chǔ)上，描述不同區(qū)域細(xì)胞對藥物的攝取行為，進(jìn)而構(gòu)建可以科學(xué)合理描述抗腫瘤藥物在腫瘤內(nèi)穿透動力學(xué)過程的數(shù)學(xué)模型。此外，通過建立熒光強度-細(xì)胞內(nèi)濃度的轉(zhuǎn)換模型，可以獲得藥物在不同區(qū)域細(xì)胞內(nèi)的累積動力學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)而減少了穿透動力學(xué)模型中的未知變量，簡化了這個模型的計算過程，增加了模型計算及參數(shù)擬合的準(zhǔn)確度。故在此模型的基礎(chǔ)上，能推測出小分子藥物(阿霉素)及大分子前藥(inno-206)在不同時間、不同區(qū)域細(xì)胞內(nèi)的累積量，且與實驗結(jié)果相關(guān)度高。除此之外，通過分析參數(shù)變化的直接原因(缺氧)，并引入對藥物在體內(nèi)的藥時動力學(xué)變化描述，可以較好地基于體外的實驗結(jié)果推算出于在體的實驗結(jié)果，實現(xiàn)體外實驗向體內(nèi)實驗的高度轉(zhuǎn)化。這一模型的建立有助于完善抗腫瘤穿透動力學(xué)評價，解決抗腫瘤藥物體內(nèi)外研究不一致的問題，并對抗腫瘤體候選化合物開發(fā)、抗腫瘤藥物臨床前評價及臨床應(yīng)用等產(chǎn)生積極作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨建立一種基于三維細(xì)胞模型的藥物穿透動力學(xué)評價模型，半定量化描述抗腫瘤藥物在實體瘤內(nèi)的穿透及累積動力學(xué)行為，實現(xiàn)基于體外實驗對在體行為的預(yù)測，并將其應(yīng)用于小分子抗腫瘤藥物及白蛋白結(jié)合的大分子藥物。即建立與在體腫瘤組織生理狀態(tài)及微環(huán)境高度相似的三維球體細(xì)胞模型，并以小分子抗腫瘤藥物阿霉素為模型藥物，探究其在球體細(xì)胞內(nèi)的分布、累積及藥效行為；通過熒光強度-濃度的轉(zhuǎn)換，獲得各層細(xì)胞對阿霉素的攝取動力學(xué)行為，并構(gòu)建“穿透動力學(xué)”數(shù)學(xué)模型，定量化描述抗腫瘤藥物在球體細(xì)胞內(nèi)的穿透及累積，并擬合得到相應(yīng)的特征動力學(xué)參數(shù)；通過分子生物學(xué)實驗手段，分析特征動力學(xué)參數(shù)的影響因素，并基于此，根據(jù)藥物的血漿藥物濃度經(jīng)時過程，推測抗腫瘤藥物在腫瘤組織內(nèi)的穿透行為；最后，將此模型及評價方法應(yīng)用于二期臨床藥物inno-206，并從瘤內(nèi)穿透這一方面，闡明其臨床藥效優(yōu)于阿霉素的原因，進(jìn)一步證實此方法的普適性。

附圖說明

圖1、基于三維球體細(xì)胞模型的藥物穿透動力學(xué)模型

圖2、建立成球率高、重復(fù)性好的三維球體細(xì)胞模型，證實其具有和在體腫瘤組織相似的生理狀態(tài)及藥物分布，更能反映藥物在在體腫瘤組織中的穿透動力學(xué)行為。

圖3、基于三維球體細(xì)胞模型，對常用抗腫瘤藥物進(jìn)行藥物動力學(xué)評價。

圖4、建立數(shù)學(xué)模型，定量化描述藥物在球體細(xì)胞內(nèi)的穿透及累積動力學(xué)過程，并證實模型描述性好、準(zhǔn)確度高。

圖5、基于免疫組化、pcr、elisa等分子生物學(xué)手段，發(fā)現(xiàn)缺氧引起的p-gp不均一高表達(dá)是影響抗腫瘤藥物分布的重要原因之一

圖6、通過在體實驗驗證體外評價結(jié)果，并實現(xiàn)基于體外實驗對在體結(jié)果的預(yù)測。

圖7、通過合成hsa結(jié)合形式，模擬二期臨床藥物inno-206在體內(nèi)的作用形式，利用已建立的基于球體細(xì)胞模型及數(shù)學(xué)模型的評價方式，分析其穿透動力學(xué)行為，并證實評價結(jié)果與在體結(jié)果高度一致，提示其具有更優(yōu)的臨床抗腫瘤藥效，與臨床結(jié)論一致。

具體實施方式

藥品與試劑

常用試劑：阿霉素購于江蘇康滿林有限公司；紫杉醇購于sigma-aldrich(st.louis，mo，usa)；人血清白蛋白購自bioss有限公司(中國，北京)；inno-206購自medchemexpress(monmouthjunction，nj，usa)。

細(xì)胞培養(yǎng)：人源性肝癌細(xì)胞hepg2購自美國菌種保藏中心(americantypeculturecollection，atcc，rockville，md)，于37℃，5％co2條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10％小牛血清(hyclone，logan，utah，usa)的高糖dmem培養(yǎng)基(gibco，glandisland，newyork)。培養(yǎng)所需的細(xì)胞培養(yǎng)耗材購于costar(cambridge，ma，usa)，球體培養(yǎng)所需的低熔點瓊脂糖購自sigma-aldrich(st.louis，mo，usa)。

lc-ms/ms：甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)購自sigma-aldrich(st.louis，mo)。甲酸及其它分析純化學(xué)試劑均購于南京化學(xué)試劑廠(江蘇，中國)。超純水由milli-qsystem(millipore，milford，ma，usa)制備。

具體實例一建立成球率高、重復(fù)性好的三維球體細(xì)胞模型，證實其具有和在體腫瘤組織相似的生理狀態(tài)及藥物分布，更能反映藥物在在體腫瘤組織中的穿透動力學(xué)行為。

(1)三維球體細(xì)胞培養(yǎng)條件摸索：以人肝癌細(xì)胞hepg2作為模型細(xì)胞。通過顯微鏡明場觀察及掃描電鏡檢測球體細(xì)胞生理生化狀態(tài)及立體結(jié)構(gòu)，最終確定最佳點板密度為7500個/孔，最佳培養(yǎng)時間為7天。并基于長短徑比值分布、球體橫截面積分布及不同批次細(xì)胞球體中所含細(xì)胞數(shù)目三個方面對最佳培養(yǎng)方式下細(xì)胞成球的穩(wěn)定性及重復(fù)率進(jìn)行考察。

(2)三維球體細(xì)胞與在體腫瘤相似性考察：將hepg2三維球體細(xì)胞及hepg2接種的荷瘤鼠的腫瘤組織，進(jìn)行he染色及ki67免疫組化，比較兩者生理狀態(tài)及增殖情況由外而內(nèi)的變化趨勢。給予三維球體細(xì)胞模型10μm的阿霉素8小時或尾靜脈給予荷瘤鼠30mg/kg的阿霉素30min，通過激光共聚焦顯微鏡對阿霉素在球體細(xì)胞模型及腫瘤組織中的藥物分布進(jìn)行考察，并進(jìn)行半定量分析，比較兩者藥物分布情況。

具體實例二基于三維球體細(xì)胞模型對常用抗腫瘤藥物進(jìn)行累積及穿透動力學(xué)評價，結(jié)果提示中心區(qū)域的細(xì)胞對藥物攝取的速度及程度顯著低于外周細(xì)胞，最終造成藥物在球體細(xì)胞內(nèi)平均累積量降低。

(1)基于單層細(xì)胞模型及球體細(xì)胞模型的攝取動力學(xué)評價。(a)單層細(xì)胞：給予10μm阿霉素或5μm紫杉醇，于37℃孵育1h、2h、4h、8h、16h、24h后撤藥，反超聲破碎細(xì)胞，-80℃保存?zhèn)溆谩?b)球體細(xì)胞：每孔加入含10μm阿霉素或5μm紫杉醇的無血清培養(yǎng)基150μl，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h、2h、4h、8h、16h、24h。反應(yīng)結(jié)束后將96孔板中每7個孔的mcts合并收集到1.5ml的ep管中，加入300μl超純水，超聲破碎細(xì)胞，-80℃保存?zhèn)溆?。?.1ml細(xì)胞懸液以bradford法測定蛋白濃度，0.1ml細(xì)胞懸液用lc-ms/ms測定藥物的細(xì)胞內(nèi)累積量。藥物的吸收通常用細(xì)胞中每毫克蛋白質(zhì)吸收的藥物量表示。以上檢測均重復(fù)三次。

(2)基于球體細(xì)胞模型的藥物分布研究：對細(xì)胞密度為7500個/孔，培養(yǎng)7天后的三維球體細(xì)胞分別給予抗腫瘤藥物(2μm或10μm阿霉素)，并于不同時間(1、4、8、16、24h)撤藥。經(jīng)4℃pbs緩沖溶液洗滌后，收集形狀規(guī)則、整體緊實的細(xì)胞球體。加入4％多聚甲醛固定。通過激光共聚焦逐層掃描技術(shù)，以10μm的間隔掃描三維球體細(xì)胞不同平面的熒光強度，并選取中間橫截面的熒光圖片對其進(jìn)行熒光半定量分析，獲得熒光強度隨距離的變化關(guān)系曲線。因為細(xì)胞內(nèi)藥物濃度和熒光強度存在線性關(guān)系，因此可以依據(jù)質(zhì)量守恒定律將熒光強度轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。公式如下所示：

其中，fn代表mcts第n層細(xì)胞的熒光強度，vcell和dcell分別表示單個細(xì)胞的體積和直徑。nn表示mcts第n層的細(xì)胞數(shù)量。mspheroid表示整個mcts的藥物摩爾數(shù)。

具體實例三建立數(shù)學(xué)模型，定量化描述藥物在球體細(xì)胞內(nèi)的穿透及累積等動力學(xué)過程，并證實模型描述性好、準(zhǔn)確度高。并基于分子生物學(xué)手段，分析參數(shù)變化的影響因素，實現(xiàn)體外評價向體內(nèi)評價的轉(zhuǎn)化。

該模型假設(shè)培養(yǎng)所得的細(xì)胞球體均為直徑為500μm的規(guī)則球體，由多層細(xì)胞構(gòu)成；藥物由外周向中心逐漸擴散，擴散速率常數(shù)為一衡量，擴散速度只與濃度差相關(guān)；球體模型中同一層細(xì)胞所處狀態(tài)相同，對藥物的攝取能力相同，且細(xì)胞對藥物攝取能力隨半徑變化是連續(xù)的；各層細(xì)胞中間存在一定的間隙，藥物在間隙中循環(huán)流動，達(dá)到平衡，使同層細(xì)胞受到的藥物暴露量相同。其中，細(xì)胞層數(shù)通過球體細(xì)胞he染色來確定。如下圖所示，n表示從球體中心向外圍的某一細(xì)胞層數(shù)，m代表總的細(xì)胞層數(shù)，d為給藥濃度，dn代表第n層細(xì)胞外的藥物暴露量，cn代表第n層細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，kn是細(xì)胞攝取速率，pn在第n層細(xì)胞的穿透系數(shù)，kpn表示在第n層細(xì)胞內(nèi)部的藥物穿透速率，xmn代表在第n層細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度閾值。

具體數(shù)學(xué)描述如下：

...........；.........；.........；

基于具體實例二中的各層細(xì)胞動力學(xué)曲線，將其帶入公式，利用forcalv9.0和matlab2009software來進(jìn)行擬合，并對比分析擬合值與實際檢測值、進(jìn)行殘差分析，驗證模型的準(zhǔn)確性及合理性。于此同時，可以得到給藥2μm或10μm阿霉素后的各層細(xì)胞的動力學(xué)參數(shù)。基于這些動力學(xué)參數(shù)，預(yù)測給藥5μm阿霉素后，各層細(xì)胞在各個時間點的胞內(nèi)藥物濃度，并與實際檢測值進(jìn)行比較，進(jìn)一步確證模型對動力學(xué)行為的描述能力。

進(jìn)一步基于免疫組化、pcr、elisa等分子生物學(xué)實驗證實缺氧導(dǎo)致的p-gp不均一表達(dá)增高是造成上述動力學(xué)參數(shù)變化的重要因素。通過在體實驗證實模型評價結(jié)果與體內(nèi)數(shù)據(jù)具有高度相關(guān)性，且通過體外模型評價預(yù)測在體實驗結(jié)果，預(yù)測結(jié)果良好。

具體實例四通過合成hsa結(jié)合形式，模擬二期臨床藥物inno-206在體內(nèi)的作用形式，利用已建立的基于球體細(xì)胞模型及數(shù)學(xué)模型的評價方式，分析其穿透動力學(xué)行為，并證實評價結(jié)果與在體結(jié)果高度一致，提示其具有更優(yōu)的臨床抗腫瘤藥效，與臨床結(jié)論一致。

(1)基于球體細(xì)胞模型的inno-206藥效評價：99.9％的inno-206在給藥后可與體內(nèi)血漿白蛋白的cystein34快速結(jié)合，形成hsa-inno206。因此，在體外研究時事先合成hsa-inno206進(jìn)行給藥，以模擬體內(nèi)的真實情況。hsa-adr的給藥濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μm，而hsa-inno206的給藥濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、40.0、50.0μm。給藥72h后利用酸性磷酸酶法(apa)測定細(xì)胞存活率，利用theblissmethod計算ic50值。

(2)基于球體細(xì)胞模型的inno-206的攝取動力學(xué)評價：給予2μmhsa-adr或2μmhsa-inno206，溫孵0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、36h、48h、60h、72h后撤藥，lc-ms/ms測定藥物的細(xì)胞內(nèi)累積量，并以每孔蛋白量進(jìn)行校正。以上檢測均重復(fù)三次。

(3)基于球體細(xì)胞模型的inno-206分布動力學(xué)研究：給予2μmhsa-inno206，于不同時間(1、4、8、16、24h、48h、60h、72h)撤藥后，收集細(xì)胞，加入4％多聚甲醛固定。通過激光共聚焦逐層掃描技術(shù)，以10μm的間隔收集三維球體細(xì)胞不同平面的熒光強度，并選取中間橫截面的熒光圖片對其進(jìn)行熒光半定量分析，并通過具體實例二中的方法得到各層藥物的攝取動力學(xué)曲線。進(jìn)而依據(jù)具體實例三中的模型，計算得到hsa-inno206的穿透動力學(xué)參數(shù)，并與hsa-adr的相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行對比。于此同時，利用cy7標(biāo)記白蛋白，通過熒光共聚焦顯微鏡分析在球體細(xì)胞內(nèi)游離阿霉素的釋放情況，

(4)基于原位荷瘤鼠模型的inno-206分布動力學(xué)研究：尾靜脈給予20mg/kgdox或29mg/kginno20648小時后，取腫瘤組織，熒光呈像，觀察藥物在腫瘤組織中的分布情況。