本發(fā)明屬于計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域，計(jì)算生物學(xué)范疇，特別涉及一種計(jì)算機(jī)藥物篩選方法及分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)的應(yīng)用。

技術(shù)背景

隨著組合化學(xué)及高通量篩選的發(fā)展，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的化合物及生物活性數(shù)據(jù)。是否可以通過隨機(jī)方式合成及篩選獲得大批的先導(dǎo)化合物，而不需要合理方式開展計(jì)算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計(jì)？1999年在美國華盛頓特區(qū)的一個(gè)關(guān)于高通量技術(shù)的學(xué)術(shù)會(huì)議上，與會(huì)者討論的一個(gè)議題是“How many leads from HTS？”令人驚訝的是，來自各大制藥公司的代表一致回答是：none。其只要原因是類藥化合物的可能數(shù)目可達(dá)6210，即使組合化學(xué)在短時(shí)間內(nèi)能提供百萬個(gè)化合物，高通量篩選能每天篩選數(shù)萬個(gè)化合物，但它們僅占類藥化合物空間的極小部分，+隨機(jī)篩選猶如大海撈針，效率是很低的。因此組合化學(xué)及高通量篩選技術(shù)必須與計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)相結(jié)合才能發(fā)揮其應(yīng)有的作用。盲目擴(kuò)大庫的容量，提高篩選速度不是一條有效地途徑。首先通過計(jì)算組合化學(xué)設(shè)計(jì)虛擬庫虛擬篩選，然后進(jìn)行小數(shù)目化合物的合成，即開展“基于知識(shí)的組合化學(xué)”是一條可取的有效途徑。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)已有數(shù)十年的歷史，近十多年來已取得實(shí)則性的進(jìn)展，已有許多藥物的研究取得成功，比如HIV蛋白酶抑制Indinavir的設(shè)計(jì)(已上市)、HIV蛋白酶環(huán)脲類抑制劑的設(shè)計(jì)(Lam1994)(曾進(jìn)入一期臨床)等。目前，CADD方法已經(jīng)成為藥物設(shè)計(jì)中的常規(guī)方法之一。而且隨著CADD方法的不斷發(fā)展和應(yīng)用的不斷深化，這種成功的實(shí)例也不斷增加。CADDF方法在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用，大大家快了藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)的速度。當(dāng)前藥物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵問題是如何命中率和速度。這需要藥物設(shè)計(jì)方法的發(fā)展及靶標(biāo)結(jié)構(gòu)及藥物作用機(jī)理方面的發(fā)展。隨著人類基因組計(jì)劃的完成和相關(guān)研究的不斷深入，大量與疾病相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)，這會(huì)促使藥物作用的靶標(biāo)分子急速增加，同時(shí)隨著對(duì)藥物作用機(jī)理的認(rèn)識(shí)，對(duì)化合物源的數(shù)目及多樣性的要求會(huì)逐步降低，命中率會(huì)逐步提高。此外，計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展日新月異，這將大大加快藥物設(shè)計(jì)的速度。同時(shí)在超級(jí)計(jì)算機(jī)的支持下，發(fā)展新的適應(yīng)復(fù)雜生物體系理論計(jì)算以及藥物設(shè)計(jì)需求的新方法和新技術(shù)。

血栓性疾病包括中風(fēng)、冠心病、肺栓塞等各種疾病，是嚴(yán)重威脅人類的生命健康、致死致殘的重要疾病之一。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，血栓性疾病占人類疾病死亡率的51％以上。目前，我國血栓性疾病患者超過1千萬，發(fā)病率遠(yuǎn)高于其他疾病，且有逐年遞增的趨勢(shì)。在血栓性疾病的發(fā)病過程中，嘌呤能受體P2Y12是刺激血栓形成的重要因子，阻斷P2Y12受體能防止血液凝固，因此其阻斷劑也是當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。當(dāng)前，市場上靶向該受體的藥物年銷售額可達(dá)數(shù)十億美元。但是，這些藥物都存在一定的副作用或者不足，例如第二代藥物對(duì)1/3病人無效，而第四代P2Y12受體阻斷劑可能導(dǎo)致病人呼吸困難等。

P2Y12是一種位于血小板表面的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，其天然配體二磷酸腺苷(ADP)是人們發(fā)現(xiàn) 最早也是體內(nèi)最重要的誘導(dǎo)血小板聚集的物質(zhì)，該受體在止血塊和病理性動(dòng)脈血栓形成中起到關(guān)鍵的作用。然而，受制于ADP在生物體內(nèi)的廣泛存在等各種客觀因素，多年來研究人員對(duì)于這一受體的各項(xiàng)研究進(jìn)展緩慢。而P2Y12受體的三維結(jié)構(gòu)以及受體配體識(shí)別方式等信息缺乏了解更進(jìn)一步嚴(yán)重制約了新的抗血栓藥物研發(fā)。

目前藥品專利的保護(hù)期限為20年，如果藥物上市前研究與開發(fā)(R&D)花費(fèi)的時(shí)間為10年，那么藥品的有效市場銷售時(shí)間就僅有10年。如果R&D時(shí)間能縮短2～3年，那么不但能節(jié)約R&D的經(jīng)費(fèi)，而且能為市場贏得寶貴的時(shí)間，這將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。因此，CADD方法已被國外許多制藥公司用于新藥的研究與開發(fā)，并且近年來已取得了極大的成功。所以，CADD方法與應(yīng)用的研究不但具有深遠(yuǎn)的科學(xué)意義，而且具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。研究者發(fā)現(xiàn)通過CADD可有效減少新藥研發(fā)過程中33％的費(fèi)用和30％的時(shí)間成本，其中虛擬篩選的介入，使新藥研發(fā)的平均周期縮短了0.9年，直接研發(fā)費(fèi)用平均降低了1.3億美元。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于自主開發(fā)一種以分子對(duì)接、虛擬篩選及全原子分子動(dòng)力學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的計(jì)算機(jī)藥物設(shè)計(jì)方法，能夠適用于GPCRs家族合理的藥物設(shè)計(jì)。

本發(fā)明的首要目的是通過計(jì)算機(jī)Autodock虛擬篩選方式得到P2Y12的先導(dǎo)藥物。該先導(dǎo)化合物有對(duì)P2Y12有抑制活性的潛力。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過Discovery Studio程序精確地選中靶點(diǎn)P2Y12的綁定口袋。以供分子對(duì)接和虛擬篩選使用。

本發(fā)明第三個(gè)目的是通過分子動(dòng)力學(xué)對(duì)篩選出的苗頭化合物進(jìn)行評(píng)估。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是通過細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證虛擬篩選得到的先導(dǎo)化合物的活性。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種以P2Y12為靶點(diǎn)的計(jì)算藥物設(shè)計(jì)方法，以分子對(duì)接、虛擬篩選及分子動(dòng)力學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)進(jìn)行計(jì)算機(jī)藥物設(shè)計(jì)，其特征包含以下五個(gè)步驟：P2Y12晶體結(jié)構(gòu)的獲取及能量最小化優(yōu)化；P2Y12受體與小分子結(jié)合口袋的定義；基于P2Y12結(jié)構(gòu)分子對(duì)接及小分子數(shù)據(jù)庫的高通量篩選；苗頭化合物與受體結(jié)構(gòu)分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)模擬；先導(dǎo)化合物的生物活性測試。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還采用如下方案：以P2Y12為靶點(diǎn)的計(jì)算藥物設(shè)計(jì)方法在以P2Y12為靶點(diǎn)的先導(dǎo)化合物計(jì)算機(jī)篩選的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還采用如下方案：以P2Y12為靶點(diǎn)的計(jì)算藥物設(shè)計(jì)方法在無晶體結(jié)構(gòu)GPCR蛋白但與其他GPCR晶體結(jié)構(gòu)同源相似率達(dá)75％以上的受體抑制劑篩選的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還采用如下方案：以P2Y12為靶點(diǎn)的計(jì)算藥物設(shè)計(jì)方法在分子對(duì)接軟件Autodock平臺(tái)的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還采用如下方案：以P2Y12為靶點(diǎn)的計(jì)算藥物設(shè)計(jì)方法在CDDOCK分 子對(duì)接程序的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還采用如下方案：以P2Y12為靶點(diǎn)的計(jì)算藥物設(shè)計(jì)方法在NAMD全原子分子動(dòng)力學(xué)模擬平臺(tái)的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還采用如下方案：以P2Y12為靶點(diǎn)的計(jì)算藥物設(shè)計(jì)方法在Chembridge數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還采用如下方案：以P2Y12為靶點(diǎn)的計(jì)算藥物設(shè)計(jì)方法在Zinc數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還采用如下方案：以P2Y12為靶點(diǎn)的計(jì)算藥物設(shè)計(jì)方法篩選出的小分子化合物在抑制P2Y12活性的應(yīng)用。

附圖說明

圖1是P2Y12晶體評(píng)估得倒的受體與小分子抑制劑相互作用的重要?dú)埢?。主要涉及Gln283、Gln282、Glu380。

圖2是對(duì)分子對(duì)接以及進(jìn)行虛擬篩選時(shí)小分子與受體的結(jié)合口袋，直接為5埃。

圖3是三個(gè)有較高細(xì)胞抑制活性的小分子與受體P2Y12分子動(dòng)力學(xué)過程中受體重要?dú)埢腞MSD值。

圖4是三個(gè)有較高細(xì)胞抑制活性的小分子化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖5是個(gè)有最高細(xì)胞抑制活性的小分子活性曲線。

圖6是該計(jì)算機(jī)藥物設(shè)計(jì)方法的流程圖。

具體實(shí)施方式

請(qǐng)參閱圖1～圖6所示，采用Discovery Studio程序，為P2Y12確定綁定口袋。

載入受體PDB結(jié)構(gòu)，使PDB結(jié)構(gòu)以卡通圖模式展示。小分子與受體作用的主要?dú)埢荖191，N159，Arg93，Cys97殘基。

(2)采用Autodock軟件對(duì)P2Y12抑制劑小分子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行虛擬篩選。將同源建模后的晶體結(jié)構(gòu)用Autodock Tools進(jìn)行處理，去掉冗余分子，按Autodock Vina運(yùn)行規(guī)則進(jìn)行分子優(yōu)化處理，加電荷，并將受體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為pdbqt格式。所有的化合物結(jié)構(gòu)從Chembridge數(shù)據(jù)庫下載，用PyRx處理和轉(zhuǎn)換成pdbqt格式.建立一個(gè)處理后的化合物數(shù)據(jù)庫.定義綁定口袋區(qū)域，定義口袋半徑為5埃。

(3)根據(jù)已經(jīng)確定的活性位點(diǎn).其它條件設(shè)為默認(rèn).選擇Lamarckian genetical gorithm(LGA)計(jì)算方法，用PyRx運(yùn)行AutodockVina，首輪篩選從大約10萬個(gè)化合物庫(Chembridge數(shù)據(jù)庫)中進(jìn)行高通量篩選，得到1200個(gè)類藥小分子化合物的庫.再從這1200個(gè)小分子化合物中篩選針對(duì)P2Y12的抑制劑.通過對(duì)建立的化合物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行6輪篩選，篩選出活性最高的3個(gè)化合物，分別為3-[7-(2-苯-環(huán)丙氨)-5-丙烷磺?；?[1，2，3]三唑[4，5-d]嘧啶-3-yl]-環(huán)戊烷-1，2-二醇、3-(7-環(huán)丙氨-[1，2，3]三唑[4，5-嘧啶-3-yl)-環(huán)戊烷-1，2-二醇、3-(7-氨基-5-丙基磺酰-[1，2，3]、三唑[4，5]嘧啶-3-yl)-環(huán)戊醇分別用化合物1、化合物2、化合物3表示。 對(duì)這三個(gè)化合物做進(jìn)一步分析。

(4)從網(wǎng)站http://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/上獲得NAMD軟件、從網(wǎng)站http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/上獲得VMD軟件和從網(wǎng)站http://www.ks.uiuc.edu/Training/CaseStudies/上獲得大多數(shù)蛋白質(zhì)分子通用的top_all27_prot_lipid.inp拓?fù)湮募?、par_all27_prot_lipid.inp力場文件和運(yùn)行NAMD的配置文件。而蛋白質(zhì)分子相對(duì)應(yīng)的psf和pdb文件，我們將用VMD軟件中的psfgen來獲得。以分子對(duì)接獲得的配體-受體復(fù)合物為起點(diǎn)，在VMD軟件中，載入復(fù)合物pdb文件，在菜單Extensions下的TK console平臺(tái)上依次輸入一下命令：

package require psfgen

topology top_all27_prot_lipid.inp

pdbalias residue HIS HSE

pdbalias residue HIE HSE

pdbalias atom ILE CD1 CD

segment EMLA{

pdb 4pxz_ptn.pdb

}patch DISU EMLA：187EMLA：195

patch DISU EMLA：281EMLA：285

coordpdb 4pxz_ptn.pdb EMLA

guesscoord

writepsf 4pxz.psf

writepdb 4pxz.pdb

這樣就將復(fù)合物分離成獨(dú)立的分子片段結(jié)構(gòu)，并生產(chǎn)相應(yīng)的psf和pdb文件。接著，在菜單Extensions下的Modeling中的Membrane Builder平臺(tái)上設(shè)置POPC在X和Y方向上都為緊接著我們?cè)贏dd Solvation Box平臺(tái)上添加一個(gè)90*90*90的水盒子，最后就可以對(duì)整個(gè)體系用AddIons來添加抗衡負(fù)離子Cl，直到體系的靜電荷為零。這樣就完成了運(yùn)行NAMD所要求的整個(gè)無配體蛋白質(zhì)體系的4pxz_popc_water_ion.psf和4pxz_popc_water_ion.pdb文件的生成。在VMD軟件中，先載入4pxz_popc_water_ion.psf文件，再載入4pxz_popc_water_ion.pdb文件。選定要固定的原子，在菜單Extensions下的TK console平臺(tái)上用set beta 1命令來生成含有固定位置信息的pdb文件，來作為優(yōu)化雙層質(zhì)膜的參考文件。在配置文件中，設(shè)置每步步長為1fs，溫度為300K，最小化3000步并運(yùn)行1ns。采用與優(yōu)化雙層質(zhì)膜相同的設(shè)置，在約束蛋白的情況下，對(duì)質(zhì)膜、水和離子進(jìn)行優(yōu)化。完成之后，在對(duì)蛋白放開約束的情況下，進(jìn)行整個(gè)體系的能量最小化和全優(yōu)化。這樣獲得的分子的初始態(tài)就可 以進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬運(yùn)行。

(5)小分子抑制劑的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)活性分析。

細(xì)胞接種在96孔板上，使用0.25％DMSO或DAPT(濃度為2.9μM-145μM)處理72小時(shí)。使用MTT染料減少檢測實(shí)驗(yàn)，稍微修正，測定細(xì)胞毒性。與DAPT溫育后，25μLMTT溶液(5mg/mL，溶于PBS)加到含200μL培養(yǎng)基的每孔中，實(shí)驗(yàn)板在37℃下溫育8小時(shí)，隨后每孔加入200μLDMSO，在室溫下震蕩30分鐘混合。通過酶聯(lián)免疫吸附法在490nm處測定吸光值。使用α-MEM及等量的MTT溶液和溶劑，作為空白對(duì)照。使用PROBIT程序在SPSS中計(jì)算IC50值。化合物1、化合物2、化合物3IC50分別為1.8Nm、9.1nM、17.2nM。