專利名稱：用于密集隨機(jī)采樣成像的系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及成像技術(shù)，并且具體地說，涉及隨著時(shí)間檢測比較弱的信號并使用檢測到的信號確定信號發(fā)射器位置的成像系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)代科學(xué)研究中采用許多不同類型的成像系統(tǒng)來獲取小物體或遠(yuǎn)距離物體的圖像，包含極高分辨率電子顯微鏡、極高分辨率掃描遂穿(SI￥)和原子力(AFM)成像儀器以 及許多不同類型的光學(xué)顯微鏡、望遠(yuǎn)鏡和圖像生成傳感器。與大多數(shù)類型的成像裝置、儀器和技術(shù)一樣，存在與不同類型顯微術(shù)相關(guān)聯(lián)的許多不同的折中和平衡。例如，透射電子顯微術(shù)在固定和稀疏分段的樣本上執(zhí)行，并且因此被約束用在實(shí)質(zhì)上二維無生命樣本上。掃描遂穿和原子力顯微術(shù)是用于獲得材料表面的高分辨率圖像的非光學(xué)技術(shù)，但不能用于獲得有關(guān)表面下面的樣本體積的納米級或微米級內(nèi)容的信息。所有類型的顯微術(shù)都以一種方式或另一種方式受分辨率限制的約束，但光學(xué)顯微術(shù)與或許著名的稱為“衍射極限”的分辨率限制相關(guān)聯(lián)，其將傳統(tǒng)的可見光光學(xué)顯微術(shù)限制到大約200nm的分辨極限。在過去的20年期間，已經(jīng)開發(fā)了各種超分辨率技術(shù)來允許通過光學(xué)熒光顯微術(shù)儀器以大大低于傳統(tǒng)光學(xué)顯微術(shù)的衍射限制分辨率的分辨率對突光標(biāo)記的樣本成像，最常見的是生物樣本。這些技術(shù)基于收集隨著時(shí)間從熒光標(biāo)記的樣本發(fā)射的熒光。假如發(fā)射熒光團(tuán)彼此分開大于約200nm的距離，或者換句話說，假如樣本中熒光團(tuán)的位置可通過傳統(tǒng)光學(xué)顯微術(shù)分辨，則樣本中熒光團(tuán)的位置在某些情況下可確定達(dá)到IOnm以下的分辨率。然而，因?yàn)閮H當(dāng)發(fā)射熒光團(tuán)稀疏地布置在樣本內(nèi)時(shí)才可判讀熒光發(fā)射信號，所以需要從稀疏布置的熒光團(tuán)的不同集合產(chǎn)生一般大量中間圖像以便構(gòu)造熒光標(biāo)記的物體的超分辨率的最終圖像。由此，以累積比較弱的信號來產(chǎn)生更大量中間圖像所需的時(shí)間為代價(jià)獲得超分辨率圖像。超分辨率成像所需的時(shí)間不利于活細(xì)胞的成像，活細(xì)胞傾向于在收集用來構(gòu)造超分辨率圖像的比較弱的信號所需的時(shí)段上移動并改變形狀。收集比較弱的信號所需的長時(shí)段還可導(dǎo)致活細(xì)胞暴露于有害或致命等級的電磁輻射，包含紫外光。獲取用于超分辨率成像的充分?jǐn)?shù)據(jù)所需的時(shí)間還可表示重大試驗(yàn)約束，不管成像的樣本類型如何。對于所有 這些原因，設(shè)計(jì)和開發(fā)、制造并使用超分辨率成像方法和儀器的那些人繼續(xù)尋找與比當(dāng)前可用的超分辨率方法論和儀器更少的時(shí)間和樣本準(zhǔn)備約束相關(guān)聯(lián)的新的且改進(jìn)的方法論和儀器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施例涉及成像技術(shù)，并且具體地說，涉及隨著時(shí)間檢測比較弱的信號并使用檢測到的信號確定信號發(fā)射器位置的成像系統(tǒng)。本發(fā)明的具體實(shí)施例涉及用于對熒光團(tuán)標(biāo)記樣本成像以便以比與光學(xué)顯微術(shù)相關(guān)聯(lián)的衍射限制分辨率大得多的分辨率產(chǎn)生樣本圖像的方法和系統(tǒng)。本發(fā)明的實(shí)施例采用交疊發(fā)射器圖像消歧以允許從密集布置的發(fā)射器收集數(shù)據(jù)，這大大減少了用于產(chǎn)生中間圖像的數(shù)據(jù)收集時(shí)間以及在計(jì)算上構(gòu)造高分辨率最終圖像所需的中間圖像數(shù)。本發(fā)明的附加實(shí)施例采用分層圖像處理技術(shù)進(jìn)一步改善和判讀經(jīng)消歧的圖像。


圖IA-B例示了典型的光學(xué)顯微鏡。圖2A-B例示了與生物樣本的可見光光學(xué)顯微術(shù)成像相關(guān)聯(lián)的成像問題。圖3A-B例示了綠色熒光蛋白(GFP)的特性。圖4示出中性形式與陰離子形式之間的GFP熒光團(tuán)的相互轉(zhuǎn)換。 圖5A-B示出了 GFP和GFP*的吸收和發(fā)射曲線。圖6A-C例示了對于在熒光顯微術(shù)中使用的各種不同蛋白和化學(xué)熒光團(tuán)觀察到的各種類型吸收和發(fā)射特性。圖7例示了熒光顯微鏡內(nèi)的光路。圖8A-B例示了通過熒光顯微術(shù)對于生物樣本獲得的大對比度。圖9提供了光學(xué)系統(tǒng)諸如標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡或突光顯微鏡的抽象表不。圖10-12例示了用于光學(xué)成像的數(shù)學(xué)模型。圖13-16例示了參考圖12討論的脈沖響應(yīng)函數(shù)h(x，y;x’，y’)的特性。圖17-18例示了上面參考圖12討論的基于卷積的數(shù)學(xué)模型，用于根據(jù)到光學(xué)系統(tǒng)的圖像輸入和光學(xué)系統(tǒng)的脈沖響應(yīng)函數(shù)計(jì)算光學(xué)系統(tǒng)的輸出圖像。圖19例示了與光學(xué)顯微術(shù)相關(guān)聯(lián)的衍射極限。圖20A-B例示了超分辨率顯微術(shù)的基礎(chǔ)。圖21例示了當(dāng)前實(shí)施的超分辨率熒光顯微術(shù)。圖22提供了描述當(dāng)前實(shí)施的超分辨率成像技術(shù)的控制流程圖。圖23提供了描述表示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的密集隨機(jī)采樣成像(DSSI)的控制流程圖。圖24A-B提供了本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例采用的在圖23的步驟2308中命名的例程“對交疊發(fā)射器圖像消歧”和由例程“對交疊發(fā)射器圖像消歧”命名的例程“應(yīng)用混合模型”的控制流程圖。圖25-29例示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例在對交疊發(fā)射器圖像消歧中使用的各種步驟。圖30A-D例示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例在圖23的步驟2313和2314中執(zhí)行的過程。圖31-33提供了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例描述圖23中分層計(jì)算圖像處理步驟2313的控制流程圖。圖34例示了執(zhí)行表示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的成像系統(tǒng)內(nèi)的圖像處理步驟的典型的電子計(jì)算機(jī)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例涉及成像技術(shù)，并且具體地說，涉及隨著時(shí)間檢測比較弱的信號并使用檢測到的信號確定信號發(fā)射器位置的成像系統(tǒng)。在下面的討論中，本發(fā)明實(shí)施例用作描述本發(fā)明的上下文，其中本發(fā)明實(shí)施例涉及用于以大于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的所謂衍射限制分辨率的分辨率對樣本具體地說是生物樣本成像的方法和儀器。然而，本發(fā)明的備選實(shí)施例涉及許多其它成像應(yīng)用。在下面將更詳細(xì)討論，本發(fā)明的實(shí)施例采用各種計(jì)算成像處理方法論，用于對交疊發(fā)射器圖像消歧，用于將幾何單元分層擬合到圖像以便進(jìn)一步精細(xì)化原始圖像，以及用于判讀圖像。圖IA-B例示了典型的光學(xué)顯微鏡。圖IA示出了光學(xué)顯微鏡102的外觀，并且圖IB例示了典型的光學(xué)顯微鏡內(nèi)的光路104。光學(xué)顯微鏡包含底座106和垂直支架108，它們一起支撐光源110、樣本臺112、許多可旋轉(zhuǎn)安裝的物鏡114以及兩個(gè)目鏡116和118中每個(gè)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)接目透鏡。樣本一般放在載玻片上，載玻片又安裝到樣本臺112的上表面以便觀看。物鏡與樣本之間的距離可通過聚焦旋鈕120調(diào)整，以便在光學(xué)上聚焦樣本內(nèi) 的具體水平平面。在顯微鏡內(nèi)，光學(xué)光路包括由光源126發(fā)射的光，其穿過樣本、一個(gè)或多個(gè)物鏡128、一個(gè)或多個(gè)鏡筒透鏡、一個(gè)或多個(gè)接目透鏡130，并通過透鏡系統(tǒng)聚焦在人眼、相機(jī)、電荷耦合器件檢測器(CCD)或其它類型空間強(qiáng)度檢測器內(nèi)的圖像平面132上。圖2A-B例示了與生物樣本的可見光光學(xué)顯微術(shù)成像相關(guān)聯(lián)的成像問題。圖2A示出了生物樣本202內(nèi)物平面的理想化抽象盤形部分。物平面部分包含各種不同類型的微米級和亞微米級的細(xì)胞結(jié)構(gòu)204-215。這些結(jié)構(gòu)可包含各種內(nèi)部細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)的膜以及其它此類細(xì)胞組分。盡管不同的細(xì)胞組分可具有不同的功能和化學(xué)成分，但它們一般具有類似的光學(xué)特性，并由此如圖2B所示，當(dāng)使用傳統(tǒng)光學(xué)顯微術(shù)觀看時(shí)，看起來彼此比較沒有差另IJ，并且經(jīng)常與背景難以區(qū)分。為了改進(jìn)不同類型細(xì)胞組分之間的對比度，使用顯微鏡的技術(shù)人員經(jīng)常用被不同組分有差別吸收的各種化學(xué)染劑給生物樣本染色。然而，許多不同類型組分甚至在染色后仍保持彼此難以區(qū)分，并且更重要的是，染劑一般是造成細(xì)胞毒害的，并且染色和固定過程一般涉及殺死生物組織的細(xì)胞。新近開發(fā)了熒光顯微術(shù)方法和儀器來解決與傳統(tǒng)光學(xué)顯微術(shù)相關(guān)聯(lián)的某些成像問題，包含上面參考圖2A-B討論的問題。通過發(fā)現(xiàn)并利用綠色熒光蛋白(GFP)、與水母發(fā)光蛋白(Aequorea victoria)原始隔離的238氨基酸(26. 9kDa)蛋白以及相關(guān)的生物和化學(xué)熒光團(tuán)，熒光顯微術(shù)已經(jīng)大大進(jìn)步了。圖3A-B例示了綠色熒光蛋白(GFP)的特性。圖3A中的立體圖像示出了 GFP的P桶三維結(jié)構(gòu)。在P桶的內(nèi)部，GFP的若干氨基酸單體子單元的側(cè)鏈組合起來產(chǎn)生熒光團(tuán)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)在圖3B中示出。熒光團(tuán)在圖3A中示為由有向帶表示的GFP P桶內(nèi)的球棍模型。圖4示出了中性形式與陰離子形式之間的GFP熒光團(tuán)的相互轉(zhuǎn)換。當(dāng)GFP內(nèi)的熒光團(tuán)處于中性形式時(shí)，GFP不被激活，并且在以下討論中被指定為“GFP”。當(dāng)GFP內(nèi)的熒光團(tuán)處于陰離子形式404時(shí)，GFP被激活，并且被指定為“GFP*”。圖5A-B示出了 GFP和GFP*的吸收和發(fā)射曲線。在圖5A和圖5B中，關(guān)于水平軸502和504上吸收或發(fā)射光的波長繪制吸收和發(fā)射曲線，其中垂直軸506和508表示相對吸收率和相對發(fā)射率。圖5A-B中的吸收率曲線是實(shí)曲線510和512，并且發(fā)射率曲線是虛曲線514和516。圖5A示出了占主導(dǎo)的是GFP但含有比較小量GFP*的平衡混合物的相對吸收率和相對發(fā)射率，這種平衡混合物表示照射之前GFP溶液的狀態(tài)。吸收率曲線是雙峰的，其中大峰值520在395nm，并且較低峰值522在475nm。雙峰吸收峰值被認(rèn)為對應(yīng)于GFP和GFP*的平衡混合物。在395nm具有最大吸收率的GFP的光吸收將GFP轉(zhuǎn)換成GFP*，其以對應(yīng)于發(fā)射曲線的峰值522的在508nm的最大發(fā)射率發(fā)射熒光。在平衡混合物中呈現(xiàn)較小量的GFP*最大地吸收波長475nm的光，并以在503nm的最大發(fā)射率發(fā)射熒光。當(dāng)GFP被395nm光強(qiáng)烈照射一段時(shí)間時(shí)，大部分GFP被轉(zhuǎn)換成GFP*。隨后，溶液的吸收率分布圖轉(zhuǎn)到圖5B所示的那個(gè)，其中單個(gè)主要吸收峰值526在475nm，對應(yīng)于GFP*的最大吸收的波長。由此，實(shí)質(zhì)上存在GFP的兩個(gè)不同狀態(tài)。未激活的狀態(tài)GFP在395nm最大地吸收光，并且在508nm最大地發(fā)射熒光，而激活的GFP、GFP*最大地吸收波長475nm的光,并且最大地發(fā)射波長510nm的突光。
GFP的基因可被絞接成對生物體的具體蛋白組分編碼以便標(biāo)記具有GFP熒光團(tuán)的蛋白的基因。通過使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)，科學(xué)家能精確地?zé)晒鈽?biāo)記各個(gè)蛋白和包含各個(gè)蛋白的細(xì)胞組分和結(jié)構(gòu)。重要的是，GFP熒光標(biāo)記可被引入到活細(xì)胞中，而沒有殺死細(xì)胞或擾亂正常細(xì)胞功能。由此，熒光標(biāo)記生物組織和熒光顯微術(shù)提供了用于解決參考圖2A-B討論的成像問題和與化學(xué)染色相關(guān)聯(lián)的問題的方法和系統(tǒng)以及用于增大生物樣本內(nèi)對比度的其它技術(shù)。由于發(fā)現(xiàn)了 GFP，因此已經(jīng)開發(fā)了大量GFP變體，具有不同的吸收和發(fā)射特性，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和/或利用了其它熒光蛋白和化學(xué)熒光團(tuán)供熒光顯微術(shù)之用。圖6A-C例示了對于在熒光顯微術(shù)中使用的各種不同蛋白和化學(xué)熒光團(tuán)觀察到的各種類型吸收和發(fā)射特性。在圖6A-C中，熒光團(tuán)由符號“F”表示。熒光團(tuán)的非發(fā)熒光形式被指定為“F/。熒光團(tuán)的漂白非發(fā)熒光形式被指定為“FB”?？杀患ぐl(fā)以發(fā)射熒光的熒光團(tuán)的不同發(fā)熒光形式被指定為“FA”、“FA1 ”和“FA2”。激發(fā)的激活熒光團(tuán)由上標(biāo)符號指定。熒光團(tuán)的不同的非發(fā)熒光和激活形式可表示熒光團(tuán)的結(jié)構(gòu)上不同的化學(xué)形式、熒光團(tuán)的不同化學(xué)環(huán)境或影響熒光團(tuán)的光吸收和發(fā)射的其它比較穩(wěn)定的差異。熒光團(tuán)的激發(fā)形式的電子已經(jīng)吸收了光能量并且已經(jīng)被推進(jìn)到了激發(fā)狀態(tài)，它隨后從激發(fā)狀態(tài)通過發(fā)射熒光而弛豫。圖6A示出了在熒光顯微術(shù)中使用的第一類型熒光團(tuán)，其初始出現(xiàn)在非發(fā)熒光形式602。在通過第一頻率V #04的光照射后，非發(fā)熒光異構(gòu)體被轉(zhuǎn)換成激活的發(fā)熒光形式606。發(fā)熒光形式606通過吸收第二頻率V 2608的光被激發(fā)，以產(chǎn)生激發(fā)形式的熒光團(tuán)610，其隨后發(fā)射熒光612，并返回到非激發(fā)激活形式的熒光團(tuán)614。熒光團(tuán)可經(jīng)歷數(shù)百、數(shù)千或更多的激發(fā)/發(fā)射循環(huán)，但在通過第二頻率的光連續(xù)照射下，最終變換成可既非激活也非激發(fā)以發(fā)熒光的漂白形式616。圖6B示出了以兩個(gè)不同激發(fā)狀態(tài)FA1*620和FA2*622為特征的第二類型熒光團(tuán)。第一形式FA1624通過吸收第一頻率626的光被激發(fā)到激發(fā)形式FA1*620，當(dāng)激發(fā)熒光團(tuán)弛豫到Fai狀態(tài)時(shí)，從激發(fā)形式Fai*第二頻率的光通過熒光發(fā)射628發(fā)射。通過第三頻率630的光照射熒光團(tuán)將熒光團(tuán)轉(zhuǎn)換成第二狀態(tài)FA2632，其可通過用第四頻率634的光照射而被激發(fā)到第二激發(fā)狀態(tài)622，其以熒光方式發(fā)射第五頻率635的光。兩種發(fā)熒光形式中的任一種都可通過連續(xù)照射而被漂白到Fb狀態(tài)640和642。圖6C示出了能在Fd與Fa狀態(tài)644與646之間可逆地相互轉(zhuǎn)換的第三類型熒光團(tuán)?？杉ぐl(fā)Fa形式來以與參考圖6A描述的激發(fā)熒光團(tuán)的類似方式以熒光方式發(fā)射光。圖7例不了突光顯微鏡內(nèi)的光路。存在許多不同類型的突光顯微鏡和對應(yīng)的光路。圖7不打算描述熒光顯微鏡的所有不同的眾所周知的變型內(nèi)的光路，而是相反例示了突光顯微術(shù)的一般原理。突光激發(fā)光702從光源諸如激光器704發(fā)射并通過激發(fā)光濾波器706。激發(fā)光從斜的二向色鏡(分光鏡)708反射，通過物鏡710到安裝到臺714的樣本712上。激發(fā)光在樣本內(nèi)激發(fā)熒光團(tuán)以發(fā)射熒光，如上面討論的。所發(fā)射的熒光，在圖7中由短劃線和星號716的虛線示出，通過物鏡710，被傳輸過二向色鏡708，通過發(fā)射濾波器720和一個(gè)或多個(gè)鏡筒透鏡722到檢測器724的圖像平面。由光源發(fā)射的激發(fā)光從樣本散射，如虛線箭頭諸如虛線箭頭726所指示的，并且通過物鏡散射回的任何激發(fā)光都從二向色鏡表面反射或被發(fā)射濾波器720吸收。由此，熒光顯微鏡的光學(xué)組件首要是將由樣本內(nèi)的熒光團(tuán)發(fā)射的熒光成像在檢測器。圖8A-B例示了通過熒光顯微術(shù)對于生物樣本獲得的大對比度。圖8A-B使用在圖2A-B中使用的相同例示慣例。圖8A示出了圖2A中所示的生物樣本內(nèi)的物平面的相同盤形部分。圖8B例示了當(dāng)已經(jīng)通過GFP或另一生物或化學(xué)熒光團(tuán)標(biāo)記生物樣本上的結(jié)構(gòu)209時(shí)通過熒光顯微術(shù)從生物樣本內(nèi)的物平面生成的圖像。熒光顯微鏡在理論上檢測從標(biāo)記結(jié)構(gòu)的熒光發(fā)射，其看起來相對于通過熒光顯微術(shù)804產(chǎn)生的圖像中的樣本的其它特征處于高對比度802。圖9提供了光學(xué)系統(tǒng)諸如標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡或突光顯微鏡的抽象表不。一般而言，光學(xué)系統(tǒng)902聚焦并放大物平面904內(nèi)的輸入圖像904以在圖像平面910上形成放大的圖像908。物平面在顯微術(shù)中一般是垂直于樣本和圖像平面內(nèi)的光軸的平面，并且一般CXD檢測器、人眼的視網(wǎng)膜或另一類型檢測器內(nèi)的圖像平面也垂直于光軸，。圖10-12例示了用于光學(xué)成像的數(shù)學(xué)模型。圖10-12使用與圖9中所用的相同的例示慣例或類似的例示轉(zhuǎn)換。如圖10中所示的，在物平面1002的輸入圖像可描述為函數(shù)
I(x, y, z=0)，其中X和y是圖像平面中的正交維度，并且z對應(yīng)于垂直于圖像平面和光學(xué)系統(tǒng)組件的光軸。函數(shù)I(x，y)的值表示物平面中各點(diǎn)的光強(qiáng)度，并且可被認(rèn)為是表面1004。輸入圖像I (X，y, z=0)可被數(shù)學(xué)建模為波函數(shù)的平方幅度
權(quán)利要求
1.一種成像系統(tǒng)，包括 光檢測子系統(tǒng)，照射樣本或部分樣本以激活所述樣本內(nèi)的光發(fā)射器，從所述光發(fā)射器激發(fā)光發(fā)射，并記錄一段時(shí)間上 所述樣本或所述部分樣本內(nèi)的光發(fā)射器的中間輸出圖像；圖像生成子系統(tǒng)，處理所述中間輸出圖像以識別并記錄所述樣本或所述部分樣本內(nèi)的所述光發(fā)射器的初始確定的位置，并且迭代地計(jì)算根據(jù)光發(fā)射器位置模型計(jì)算的輸出圖像，以便對所述中間輸出圖像中的交疊光發(fā)射器圖像消歧以產(chǎn)生包含所述樣本或所述部分樣本內(nèi)所述光發(fā)射器的位置指示的合成圖像；以及 圖像判讀子系統(tǒng)，迭代地將幾何圖元擬合到由所述圖像生成子系統(tǒng)產(chǎn)生的所述合成圖像，以便產(chǎn)生所述樣本或所述部分樣本的一個(gè)或多個(gè)精細(xì)化和判讀的圖像。
2.如權(quán)利要求I所述的成像系統(tǒng)，其中所述光檢測子系統(tǒng)包括熒光顯微術(shù)光學(xué)子系統(tǒng)。
3.如權(quán)利要求2所述的成像系統(tǒng)，其中所述光發(fā)射器是熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)通過暴露于第一頻率的光由照射激活并且通過暴露于第二頻率的光被激發(fā)以發(fā)射熒光。
4.如權(quán)利要求3所述的成像系統(tǒng)，其中所述光發(fā)射器是熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)通過暴露于第一頻率的光被激活并且通過暴露于第二頻率的光被激發(fā)以發(fā)射熒光。
5.如權(quán)利要求I所述的成像系統(tǒng)，其中所述圖像生成子系統(tǒng)通過下述步驟來處理每個(gè)中間圖像 從所述中間圖像濾除噪聲以產(chǎn)生經(jīng)噪聲濾除的中間圖像； 從所述經(jīng)噪聲濾除的中間圖像中選擇局部極大值； 從所選擇的局部極大值中選擇光發(fā)射器；以及 對交疊光發(fā)射器圖像消歧以便將任何附加的所檢測的光發(fā)射器添加到所選擇的光發(fā)射器位置。
6.如權(quán)利要求5所述的成像系統(tǒng)，其中所述圖像生成子系統(tǒng)通過對所述中間圖像應(yīng)用高斯濾波器，從所述中間圖像中濾除噪聲。
7.如權(quán)利要求5所述的成像系統(tǒng)，其中所述圖像生成子系統(tǒng)通過選擇具有比所述中間圖像中所有相鄰像素或體素更高的相關(guān)聯(lián)強(qiáng)度值的像素或體素，從經(jīng)噪聲濾除的中間圖像中選擇局部極大值。
8.如權(quán)利要求5所述的成像系統(tǒng)，其中所述圖像生成子系統(tǒng)通過下述步驟從所選擇的局部極大值中選擇光發(fā)射器 作為在所述圖像中的所述局部極大值的鄰域上計(jì)算的曲率和所述局部極大值的鄰域的平均強(qiáng)度之積，計(jì)算每個(gè)局部極大值的光點(diǎn)度量；以及 選擇所計(jì)算的光點(diǎn)度量大于閾限值的那些局部極大值作為光發(fā)射器。
9.如權(quán)利要求5所述的成像系統(tǒng)，其中所述圖像生成子系統(tǒng)通過下述步驟對交疊光發(fā)射器圖像消歧，以便將任何附加的所檢測的光發(fā)射器添加到所選擇的光發(fā)射器 將所述光發(fā)射器劃分成各包括一個(gè)或多個(gè)初始光發(fā)射器的簇；以及 對于每個(gè)簇，迭代地 將所選擇的初始光發(fā)射器的伙伴插入到所述簇中， 將初始光發(fā)射器位置和所述伙伴位置擬合到所述簇的觀測強(qiáng)度， 計(jì)算所述簇的計(jì)算圖像，根據(jù)所述計(jì)算圖像和觀測圖像來計(jì)算殘差統(tǒng)計(jì)，以及 當(dāng)統(tǒng)計(jì)測試指示對于包含所述伙伴的所述簇計(jì)算的所述殘差統(tǒng)計(jì)好于在插入所述伙伴之前對于所述簇計(jì)算的殘差統(tǒng)計(jì)時(shí)，將所述伙伴添加到所述簇。
10.如權(quán)利要求9所述的成像系統(tǒng)，其中計(jì)算所述簇的計(jì)算圖像包含將每個(gè)光發(fā)射器和所述伙伴建模為參數(shù)化的高斯強(qiáng)度分布。
11.如權(quán)利要求I所述的成像系統(tǒng)，其中每個(gè)中間圖像包括相對于所述成像系統(tǒng)的光軸在樣本位置范圍上獲得的若干二維圖像。
12.如權(quán)利要求I所述的成像系統(tǒng)，其中所述圖像判讀子系統(tǒng)通過下述步驟迭代地將幾何圖元擬合到由所述圖像生成子系統(tǒng)產(chǎn)生的所述合成圖像，以便產(chǎn)生所述樣本或所述部分樣本的一個(gè)或多個(gè)精細(xì)化和判讀的圖像 迭代地 選擇當(dāng)前考慮的分層處理級的幾何元素集合； 遞歸地將來自所述幾何元素集合的幾何元素?cái)M合到來自前一迭代的中間精細(xì)化圖像，或在第一迭代中擬合到由所述圖像生成子系統(tǒng)產(chǎn)生的所述合成圖像，以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)候選精細(xì)化圖像；以及 選擇候選精細(xì)化圖像供在隨后迭代或在最終迭代中處理，作為一個(gè)或多個(gè)精細(xì)化和判讀的圖像。
13.如權(quán)利要求12所述的成像系統(tǒng)，其中所述圖像判讀子系統(tǒng)通過下述步驟選擇當(dāng)前考慮的分層處理級的幾何元素集合 選擇大小和復(fù)雜性適合于當(dāng)前考慮的分層處理級的幾何元素；以及 從大小和復(fù)雜性適合于當(dāng)前考慮的分層處理級的那些幾何元素當(dāng)中選擇與在所述樣本內(nèi)出現(xiàn)的已知結(jié)構(gòu)和特征兼容的幾何元素。
14.如權(quán)利要求12所述的成像系統(tǒng)，其中所述圖像判讀子系統(tǒng)執(zhí)行幾何元素?cái)M合搜索，以便考慮幾何元素到來自前一迭代的所述中間精細(xì)化圖像或在第一迭代中到由所述圖像生成子系統(tǒng)產(chǎn)生的所述合成圖像的大量可能映射。
15.如權(quán)利要求14所述的成像系統(tǒng)，其中通過來自前一迭代的所述中間精細(xì)化圖像或在第一迭代中由所述圖像生成子系統(tǒng)產(chǎn)生的所述合成圖像的特征被覆蓋或被包含在在當(dāng)前迭代中擬合到它們的幾何元素內(nèi)的程度以及所述候選圖像中的特征對應(yīng)于在所述樣本中出現(xiàn)的已知結(jié)構(gòu)和特征的似然，來評估候選圖像。
16.如權(quán)利要求14所述的成像系統(tǒng)，其中通過來自前一迭代的所述中間精細(xì)化圖像或在第一迭代中由所述圖像生成子系統(tǒng)產(chǎn)生的所述合成圖像的特征被覆蓋或被包含在所述幾何元素內(nèi)的程度以及通過將所述幾何元素?cái)M合到所述一個(gè)或多個(gè)特征產(chǎn)生的所述候選圖像中的任何中間特征對應(yīng)于在所述樣本中出現(xiàn)的已知結(jié)構(gòu)和特征的似然，來評估幾何元素到來自前一迭代的所述中間精細(xì)化圖像或在第一迭代中到由所述圖像生成子系統(tǒng)產(chǎn)生的所述合成圖像的一個(gè)或多個(gè)特征的擬合。
17.一種用于產(chǎn)生圖像的方法，所述方法包括 重復(fù)地 照射樣本或部分樣本以激活所述樣本內(nèi)的光發(fā)射器， 從所述光發(fā)射器激發(fā)光發(fā)射，以及記錄一段時(shí)間上所述樣本或所述部分樣本內(nèi)光發(fā)射器的中間輸出圖像； 處理所述中間輸出圖像以識別并記錄所述樣本或所述部分樣本內(nèi)所述光發(fā)射器的初始確定的位置； 迭代地計(jì)算根據(jù)光發(fā)射器位置模型計(jì)算的輸出圖像，以便對所述中間輸出圖像中的交疊光發(fā)射器圖像消歧以產(chǎn)生包含所述樣本或所述部分樣本內(nèi)所述光發(fā)射器的位置指示的合成圖像；以及 迭代地將幾何圖元擬合到由所述圖像生成子系統(tǒng)產(chǎn)生的所述合成圖像，以便產(chǎn)生所述樣本或所述部分樣本的一個(gè)或多個(gè)精細(xì)化和判讀的圖像。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中處理所述中間輸出圖像以識別并記錄所述樣本 或所述部分樣本內(nèi)所述光發(fā)射器的初始確定的位置還包含 從所述中間圖像濾除噪聲以產(chǎn)生經(jīng)噪聲濾除的中間圖像； 從所述經(jīng)噪聲濾除的中間圖像中選擇局部極大值； 從所選擇的局部極大值中選擇光發(fā)射器；以及 對交疊光發(fā)射器圖像消歧以便將任何附加的所檢測的光發(fā)射器添加到所選擇的光發(fā)射器位置。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中迭代地計(jì)算根據(jù)光發(fā)射器位置模型計(jì)算的輸出圖像，以便對所述中間輸出圖像中的交疊光發(fā)射器圖像消歧以產(chǎn)生包含所述樣本或所述部分樣本內(nèi)所述光發(fā)射器的位置指示的合成圖像還包含 將所述光發(fā)射器劃分成各包括一個(gè)或多個(gè)初始光發(fā)射器的簇；以及 對于每個(gè)簇，迭代地 將所選擇的初始光發(fā)射器的伙伴插入到所述簇中， 將初始光發(fā)射器位置和所述伙伴位置擬合到所述簇的觀測強(qiáng)度， 計(jì)算所述簇的計(jì)算圖像， 根據(jù)所述計(jì)算圖像和觀測圖像來計(jì)算殘差統(tǒng)計(jì)，以及 當(dāng)統(tǒng)計(jì)測試指示對于包含所述伙伴的所述簇計(jì)算的所述殘差統(tǒng)計(jì)好于在插入所述伙伴之前對于所述簇計(jì)算的殘差統(tǒng)計(jì)時(shí)，將所述伙伴添加到所述簇。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中迭代地將幾何圖元擬合到由所述圖像生成子系統(tǒng)產(chǎn)生的所述合成圖像以便產(chǎn)生所述樣本或所述部分樣本的一個(gè)或多個(gè)精細(xì)化和判讀的圖像還包含 迭代地 選擇當(dāng)前考慮的分層處理級的幾何元素集合； 遞歸地將來自所述幾何元素集合的幾何元素?cái)M合到來自前一迭代的中間精細(xì)化圖像，或在第一迭代中擬合到由所述圖像生成子系統(tǒng)產(chǎn)生的所述合成圖像，以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)候選精細(xì)化圖像；以及 選擇候選精細(xì)化圖像供在隨后迭代或在最終迭代中處理，作為一個(gè)或多個(gè)精細(xì)化和判讀的圖像。
全文摘要
本發(fā)明的實(shí)施例涉及成像技術(shù)，并且具體地說，涉及隨著時(shí)間檢測比較弱的信號并使用所檢測的信號確定信號發(fā)射器位置的成像系統(tǒng)。本發(fā)明的具體實(shí)施例涉及用于成像熒光團(tuán)標(biāo)記樣本以便以比與光學(xué)顯微術(shù)相關(guān)聯(lián)的衍射限制分辨率大得多的分辨率產(chǎn)生樣本圖像的方法和系統(tǒng)。本發(fā)明的實(shí)施例采用交疊發(fā)射器圖像消歧以允許從密集布置的發(fā)射器收集數(shù)據(jù)，這大大減少了用于產(chǎn)生中間圖像的數(shù)據(jù)收集時(shí)間以及在計(jì)算上構(gòu)造高分辨率最終圖像所需的中間圖像數(shù)。本發(fā)明的附加實(shí)施例采用分層圖像處理技術(shù)進(jìn)一步分辨和判讀消歧圖像。
文檔編號G06T1/00GK102656442SQ201080058539
公開日2012年9月5日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者達(dá)努瑟 G., C. 古德文 P. 申請人:應(yīng)用精密公司