專利名稱：小型自動化細胞計數(shù)器的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血液凝固以及一般用于對流體中懸浮的生物細胞進行計數(shù)的系統(tǒng)的領域。本發(fā)明的重點在于自動化細胞計數(shù)系統(tǒng)。
背景技術：
在各種臨床和研究過程中，細胞計數(shù)是令人感興趣的，其中包括白細胞和紅血球的計數(shù)，而這在各種疾病或異常狀況的診斷過程中以及在監(jiān)控經(jīng)歷這種疾病或狀況的治療的病人的過程中是很有價值的?？梢酝ㄟ^下列過程對細胞進行人工計數(shù)將已知的樣品稀釋物放置在光學清晰的板之間，這些板彼此充分地靠近(通常，間隔是在100微米的量級) 以使這些細胞形成單一的層；將該層的一區(qū)域在指定維度上放大到已知的倍數(shù)；以及通過顯微鏡對被放大的區(qū)域中的細胞進行計數(shù)。人工細胞計數(shù)器通常包括刻在計數(shù)區(qū)域中的柵格以減小使用者的負擔。Qiu，J的美國專利US 7，329，537B2(2008年2月12日授權，題為 "Micro-Pattern Embedded Plastic Optical Film Device for Cell-Based Assays”)描述了這種柵格及其使用過程。不管這是如何實現(xiàn)的，人工細胞計數(shù)都是乏味的，且使用者很容易出錯。通過使用該樣品的高度稀釋物以減小計數(shù)區(qū)域中的細胞數(shù)目，常常有助于計數(shù)， 但是，被計數(shù)的那部分細胞每每有所減少，該計數(shù)的準確度就會下降。通過使用數(shù)字成像系統(tǒng)，已使細胞計數(shù)過程的自動化變?yōu)榭赡?。這種系統(tǒng)的示例是ImageJ，一種在國家衛(wèi)生學院開發(fā)的基于Java的圖像處理程序，Collins, T.J.的 JC Μ" ImageJ for microscopy" (BioTechniques 43 (lSuppl.) :25-30, 2007 ^ 7 ^ ) X^t 此進行過報道。Gering，T.E.和 C. Atkinson 在文章‘‘A rapid method for counting nucleated erythrocytes on stained blood smears by digital image analysis" (J. Parasitol.90(4) :879-81, 2004年)中報道了在血液系統(tǒng)中使用ImageJ的情況。下列文獻進一步描述了自動化細胞計數(shù)Chang，J. K.等人的美國專利US 7，411，680B2，2008年，8 月 12 日授權，題為 ‘‘Device for Counting Micro Particles” ；以及 Chang，J. K 等人的美國專利申請公報 US 2006/0223165Α1，2006 年 10 月 5 日公布，題為 ‘‘Device for Counting Cells and Method for Manufacturing the Same，，。自動化細胞計數(shù)系統(tǒng)自身包含固有的統(tǒng)計不確定性，這是由通常所謂的“采樣誤差”所導致的，這種“采樣誤差”是指在選擇執(zhí)行自動化計數(shù)的區(qū)域時固有的誤差。目前可買到的自動化細胞計數(shù)器的諸多局限之一是因為儀器中的光學部件的限制，對細胞進行計數(shù)的區(qū)域與樣品所占據(jù)的整個區(qū)域相比具有有限的大小。因為這相應地限制了細胞的數(shù)目，并且被計數(shù)的細胞的數(shù)目每每有所減小，誤差就會增大，所以現(xiàn)有技術的典型儀器被構造成具有很長的光路或很大的覆蓋區(qū)(該儀器在試驗臺上所占據(jù)的表面積)或兩者皆有以實現(xiàn)可接受的準確度。這給使用者帶來了不便，特別是當該儀器要被用在細胞培養(yǎng)蓋中的時候。

發(fā)明內(nèi)容
本文揭示了一種用于高度準確的細胞計數(shù)的完全獨立的儀器，用戶干預最少，覆蓋區(qū)相對很小，且高度也有限。將細胞懸浮液放在可消耗的樣品容器中，該容器的尺寸和維度可以寬泛地變化，該容器的一個方便的示例是其外部尺寸與顯微鏡載玻片相似的容器。 該容器由此可以在構造與尺寸方面相似于上述US 2006/0223165A1中所描述的容器，該容器具有至少一個平且淺的內(nèi)部腔室，該內(nèi)部腔室的頂部和底部以平的、光學清晰的窗口為界，這些窗口可以是塑料片且間隔得足夠近以使得大部分樣品細胞構成一個層即一個細胞那么深。在該容器中可以包括合適的入口和出口，以允許用樣品輕易且完全地填滿該腔室。 然后，將該容器放到該儀器中，在該儀器中該容器與線性光路相交。在本文中所使用的術語 “線性”表示一條在光束方向上除了透鏡所導致的轉彎或變化以外沒有轉彎或其它變化的路徑。該容器通過該光路中的指定高度處的狹縫而進入該儀器，并且如下文所更詳細地描述的那樣，本發(fā)明的某些實施例中的儀器包括多個特征項，用于自動地調節(jié)樣品的高度以便聚焦樣品圖像。某些實施例包括多個特征項，用于使所有的儀器功能在將樣品容器插入該儀器中時就開始工作。


圖1是代表本文所揭示的概念的實現(xiàn)示例的細胞計數(shù)儀器的透視圖。圖2是圖1的儀器的光學部件的圖。圖3是圖1的儀器的內(nèi)部中的光學部件的透視圖。圖4是在圖1的儀器中所使用的用于構成樣品載玻片的兩個板的分解透視圖。圖5A是圖4的樣品載玻片的頂板的上表面的圖。圖5B是圖4的樣品載玻片的頂板的下表面的圖。
具體實施例方式在頂部光學窗口和底部光學窗口之間，使細胞懸浮液保持在樣品容器之內(nèi)，該頂部光學窗口和底部光學窗口靠得足夠近，使得所保持的懸浮液是一個薄膜，該薄膜的橫向維度即它露出的長度和寬度至少比它的厚度大一個數(shù)量級。樣品腔室的整個露出的區(qū)域 (即橫向維度)或其橫向維度部分用作一個視場，該視場被投射到數(shù)字成像傳感器上，該傳感器包含至少約4，000, 000
(四百萬)個像素或者在某些實施例中包含約4，000, 000到10，000, 000個像素，每個像素的尺寸不大于約2X2 μ πΚ4 μ m2)或者在某些實施例中約為0. 5X0. 5 μ m(0. 25 μ m2)到 2Χ2μπ (4μπ 2)并且在后者的某些實施例中約為1Χ1μ (1μπ 2)至Ij 2 X 2 μ m (4 μ Hl2)。被傳感器成像的視場至少約為3平方毫米，通常約為3-10平方毫米?；パa金屬氧化物半導體 (CMOS)是用于此目的的數(shù)字成像傳感器的一個示例。符合這些參數(shù)的CMOS傳感器的示例是可從美國加利福尼亞州Santa Clara市的OmniVision公司買到的0V5620和0V5632彩色成像器。其它示例則可以從美國加利福尼亞州San Jose市的Micron "Technology公司的Aptina Imaging部門購買到。也可以使用彩色數(shù)字成像傳感器。通過已知的數(shù)字計數(shù)方法，比如上文提到的那些，可以實現(xiàn)圖像處理以對CMOS傳感器所產(chǎn)生的圖像中的細胞進行計數(shù)。沿著光路，可以按一個放大倍數(shù)放大樣品腔室的圖像，該放大倍數(shù)通常是在約1. 5 到6的范圍中或者是在約1. 5到3的范圍中，作為一個示例，該放大倍數(shù)約為2。這可以通過一種雙透鏡式消色差透鏡組件來實現(xiàn)。這種透鏡組件的示例是最靠近樣品的35mm焦距的透鏡，最靠近傳感器的60mm焦距的透鏡，以及在這兩個透鏡之間的孔徑。由此，在本示例中，最靠近樣品的透鏡與樣品自身之間的距離是35mm，并且最靠近傳感器的透鏡與成像器自身之間的距離是60mm。系統(tǒng)的放大倍數(shù)是這兩個透鏡的焦距之比，在這種情況下就是 60mm/35mm = 1. 7。例如，這兩個透鏡的直徑可以是12. 5mm，上述孔徑的直徑可以是6mm。會產(chǎn)生相同或大致相同的結果的其它直徑和焦距的透鏡對于本領域技術人員而言是顯然的。 該儀器的覆蓋區(qū)被定義為該儀器及其支撐基座中較大的那個在垂直于光路的平面上所投射的區(qū)域。如上所述，該儀器可以被構造成具有很小的覆蓋區(qū)，特別是其面積小于300平方厘米的覆蓋區(qū)。當使用平的數(shù)字成像傳感器時，負透鏡可以位于該傳感器下方以立刻截斷光信號并校正該消色差透鏡對的聚焦場曲率。這種場曲率在多種光學系統(tǒng)中是普遍的，也被稱為 Petzval曲率。在示例的實施例中，使用了具有負18mm焦距的6mm直徑透鏡。透鏡厚度可以有所改變，但最好被選擇成能校正上述曲率而不顯著減小視場。通過使用在儀器基座處的常規(guī)光源以及在該光源與樣品之間的準直透鏡，可以實現(xiàn)該樣品的照明。使用這些部件，就可通過透射照明來照射該樣品，而無需漫射器。較佳的光源是單個具有熒光涂層的白色發(fā)光二極管(LED)。這種部件的示例是LUXEON Rebel White，部件號碼為LXML-PWN1-0050，可從美國加利福尼亞州San Jose市的Philips Lumileds Lighting公司購買到。準直透鏡的示例是直徑為9mm且焦距為18mm的透鏡。使用這些尺寸和上文所提到的尺寸，可以構造出一種儀器，該儀器的消色差透鏡對大約在樣品上方35mm，該儀器的傳感器大約在該消色差透鏡對上方60mm。在消色差透鏡對具有大約 13mm的厚度的情況下，樣品與傳感器之間的總距離可以小到108mm。通常，該儀器的光路 (即，在本文中被定義為從光源延伸到CMOS或其它數(shù)字成像傳感器的多個部件的排布)的高度可以是20cm或更小點。在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的較佳儀器中，使用順從性的計數(shù)按一種浮置的方式將多個光學部件安裝到外殼內(nèi)部，以避免在震到該儀器時光學系統(tǒng)被破壞或失調，比如當儀器發(fā)生衰落或使用不當或與另一個儀器或轉變相撞時可能出現(xiàn)這種破壞或失調。如上所述，通過一狹縫，將樣品容器(考慮到其尺寸與形狀相似于顯微鏡載玻片， 在下文中將被稱為樣品載玻片)收納到上述儀器中，該狹縫位于沿著上述光路的一位置， 該位置離上述消色差透鏡對的最接近的透鏡的距離等于該透鏡的焦距。在其較佳實施例中，該儀器整體的高度是30cm或更小些，并且按上文所述使用數(shù)字成像傳感器(該傳感器使用大量的小尺寸像素)能允許該儀器被構造成具有足夠高的狹縫以允許用戶舒適地用手插入該狹縫(即讓用戶的手不會碰到該儀器所在的桌子)。由此，該狹縫可以離該儀器的底座有60mm或更大，最好離該底座有70-80mm。在本發(fā)明的較佳實施例中，通過在插入載玻片之后自動地調節(jié)該載玻片的高度，上述儀器提供了樣品圖像的自動聚焦。一種自動聚焦手段包括使用圖像處理器芯片，該芯片提供了在來自傳感器的圖像上的多個區(qū)域的陣列之內(nèi)的圖像對比的輸出。這種芯片的示例是可從美國得克薩斯州Plano市ARM公司Keil 買到的的“Freescale Semiconductor MC93^MX21”；其它示例對于本領域技術人員而言是很明顯的。在傳感器陣列的特定區(qū)域中相鄰的綠色像素的絕對差異之和可以被用作圖像對比值，并且當該圖像對比值達到最大時就實現(xiàn)了最佳聚焦。通過連接到上述收納狹縫內(nèi)的載玻片托板的齒輪馬達，可以調節(jié)上述聚焦，即，馬達在轉動時將使載玻片托板向上或向下移動以改變圖像的聚焦情況。在馬達的各個位置處檢測該對比值，然后，返回到產(chǎn)生最高對比值的位置。在該儀器的許多實施例中，這種自動聚焦可以發(fā)生在15秒或更少的時間內(nèi)?？蔀樵搩x器提供的附件是標準載玻片，用于質量控制，比如用于驗證對活細胞和死細胞進行計數(shù)的準確度以及該儀器進行恰當聚焦的能力。該標準載玻片可以具有與樣品載玻片相同的外部尺寸，但是和樣品腔室不一樣，該標準載玻片可以具有印刻在其上的暗色斑點和環(huán)，這些斑點模擬死細胞并且在數(shù)字成像傳感器中被當作死細胞來檢測，而這些環(huán)則模擬活細胞并且在數(shù)字成像傳感器中被當作活細胞來檢測。在本文所描述的諸多概念的某些實施例中，通過簡單地插入樣品載玻片，就啟動了該儀器所執(zhí)行的功能(包括自動聚焦和細胞計數(shù))。通過在上述狹縫內(nèi)或上述狹縫內(nèi)的載玻片托板上放置一個非接觸的光學反射傳感器，就可以實現(xiàn)這種啟動。合適的傳感器的示例是這樣一種傳感器，它能發(fā)射紅外光束并通過檢測該光束的反射信號而檢測到傳感器孔徑的約1毫米內(nèi)的物體。當載玻片被插入時，該反射信號將達到最大，并且高信號將啟動自動聚焦和細胞計數(shù)機制。可用于該目的的傳感器的一個示例是“QRE1113反射式物體傳感器”，這可以從美國加利福尼亞州San Jose市的仙童半導體公司買到。其它示例對于本領域技術人員而言是很明顯的。在具體實施本文所描述的諸多特征的儀器中，可包括的另一個特征是自動檢測被活體染色劑沾染的樣品中的細胞?；铙w染色劑是用于優(yōu)先沾染死細胞的染色劑，并且被這種染色劑沾染的細胞與未被沾染的細胞之間的差異是通過使用不同顏色的像素來實現(xiàn)的。錐蟲藍是活體染色劑的一個示例，曙紅和亞丙基是其它示例。錐蟲藍使藍光透射并使紅光衰減，并且通過比較圖像傳感器中的藍色像素和紅色像素的強度，該儀器就可以確定是否存在被活體染色劑沾染的細胞。其它染料將提供相似的顏色區(qū)分，只要對染料自身合適就行。包括這種自動檢測特征的圖像處理芯片包括上文所提及的那些且很容易買到。可以對該儀器進行編程，以通過在兩個或更多個平面上進行聚焦來消除任何可能的活細胞漏記，由此活細胞檢測可達到特別高的準確度。通過使用濾光片來控制照明帶寬，或者通過選擇光譜很窄的光源(比如特定顏色的LED而非白光)，就可以進一步增大活細胞與死細胞之間的對比。例如，可以使用具有約20nm帶寬的585nm濾光片，以使上述照明匹配于錐蟲藍染料的峰值吸收波長(其峰值吸收是586nm)。當通過這種濾光片照射該樣品時，死細胞將看起來更暗一些。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的較佳儀器中，對樣品中的細胞計數(shù)的獲得有貢獻的所有功能都被包含在該儀器外殼內(nèi)，由此，可以實現(xiàn)該儀器的完全操作而無需使用外部機器或計算機。在這些功能中，包括了下列通過改變樣品載玻片的高度來自動聚焦，以找到最佳焦平面，從而將細胞與背景區(qū)分開來；確定該樣品是否已被錐蟲藍或其它活體染色劑沾染；當檢測到活體染色劑時，進行多焦平面分析，使得在多個焦平面上記下每一個細胞，以防止活細胞的漏記；集成的稀釋計數(shù)器，用于確定要使用的細胞懸浮液的體積；在用戶選擇時，能在顯示器上產(chǎn)生這些細胞的可視化圖像并且能放大以便仔細查看這些細胞；以及在用戶選擇時，能將這些結果輸出到USB閃存驅動器或熱打印機或其它外部打印機。通過上文所描述的非接觸的光學反射傳感器，簡單地插入樣品載玻片就可以啟動所有這些功能，并且在許多情況下，這些功能的執(zhí)行是在30秒或更少的時間內(nèi)完成的。附圖所描繪的儀器包含了許多上述的特征，并用作本文所描述的諸多功能的實現(xiàn)示例。圖1描繪了一種處于其直立位置中的自動細胞計數(shù)器儀器11，它在試驗臺上使用時就是這樣子。該儀器的可見部分是外殼12，支撐底座13，顯示屏幕14，控制面板15，以及用于插入樣品載玻片17的狹縫16。顯示屏幕示出了細胞計數(shù)分析的過程，標識了該儀器的正被執(zhí)行的各種功能，并且向用戶提供多種選項，用于多種功能，和用于示出在樣品載玻片中的細胞的圖像。圖2描繪了圖1的儀器內(nèi)部的光路的各種部件，樣品載玻片17已經(jīng)被放置到該光路中了。樣品載玻片17是水平的，并且位于用作光源的LED板22的上方。準直透鏡23使來自該LED的光線在接近該樣品載玻片時變?yōu)槠叫小Ｏ钔哥R對M位于樣品載玻片17 和傳感器25之間。消色差透鏡對的這兩個透鏡沈、27被一孔徑觀分開。場平整透鏡四緊挨在傳感器25下方。圖3描繪了主要的光學組件，示出了 載玻片托板31，樣品載玻片17被部分地插入其中；LED板22 ；照明(準直)透鏡23 ；齒輪馬達32，用于調節(jié)載玻片高度以聚焦該圖像； 以及成像透鏡管33，端接于裝配件34以收納CMOS傳感器板。圖中還示出了主要的印刷電路板35，用于控制該儀器的各種功能并且包括馬達驅動芯片以控制馬達32。板35位于外殼之內(nèi)，該板在圖中的位置反映了其相對于光學組件的位置。圖4、5A和5B示出了之前的圖中的儀器中所使用的樣品載玻片。圖4是透視圖， 并且載玻片17是由兩個接合到一起的平板42、43(但是圖中顯示成分開了)構成的。該載玻片包含兩個樣品腔室，被分別標記為“A”和“B”，這兩個樣品腔室沿著該載玻片縱向地彼此分開且橫向地彼此偏離。構成樣品腔室底面的下平板43的區(qū)域44、45是由光學透明材料制成的，正如上平板42的相應區(qū)域那樣，這些相應區(qū)域直接位于下平板上的這些區(qū)域上方并構成樣品腔室的頂面。在本實施例中，下平板43比上平板42厚以向載玻片提供剛性， 并且上平板42相對較薄就能允許每個樣品腔室的頂部窗口比底部窗口要薄一些且事實上盡可能薄從而在CMOS傳感器中實現(xiàn)高度聚焦的圖像。由此，每個樣品腔室離載玻片的中心平面有所偏離，并且與下平板43相比更靠近上平板42。圖5A和5B分別是上平板42的頂面51和底面52的平面圖，底面52是接合到下平板43的那個表面。每個樣品腔室是由上平板的底面中的凹陷53(圖5B)所定義的，這進一步減小了在每個樣品腔室頂部形成光學清晰窗口的區(qū)域的厚度。在載玻片的尺寸的一個示例中，上平板中除了凹陷53以外的區(qū)域的厚度是0. 65mm，下平板的厚度是1.00mm，總的載玻片厚度是1. 65mm。凹陷53的深度是0. 100mm,由此形成了深度為0. IOOmm的樣品腔室， 這是人工血細胞計數(shù)器的標準樣品腔室深度。每個樣品腔室具有兩個入口或出口討、55， 細長的腔室的兩個相對的縱向末端處各有一個。在載玻片頂部敞開的溢出區(qū)域56、57、58、59位于每個樣品腔室的四個角落處以容納多余的樣品，由此確保樣品腔室被樣品恰當?shù)靥?br> 、/斗倆。因為每個樣品腔室更靠近上平板42而非下平板43，所以當載玻片被恰當?shù)夭迦氲郊毎嫈?shù)器中且上平板42位于頂部且因此最薄的光學窗口也位于頂部的時候，該載玻片就發(fā)揮最佳的功能。為了確保按這種取向來插入該載玻片，在載玻片的兩個對角線相對的角處形成凹口 61、62。細胞計數(shù)器中的狹縫(載玻片就被插入該狹縫中以啟動該細胞計數(shù)器的多種功能)的內(nèi)表面包含與這些凹口互補的輪廓特征。由此，這些凹口與狹縫中的互補的輪廓能防止用戶插入載玻片時上下顛倒了，即上平板42在底部了(應該在頂部)。這些凹口的對稱排布也與兩個樣品腔室的對稱排布互補，并且在插入載玻片時允許任一末端先插入，同時防止以倒逆的位置插入載玻片(上下顛倒)。因為載玻片最好是可消耗物品， 所以它可以被用于在不同的時刻對兩個獨立的樣品進行細胞計數(shù)測量，并且一旦兩個腔室都已被使用則該載玻片可以被丟棄且不再被使用。對于本領域技術人員而言，很明顯，在確保恰當?shù)娜∠虻那闆r下，樣品載玻片的構造可以有所改變。由此，可以改變凹口的排布、數(shù)目和形狀，正如樣品腔室的數(shù)目及其在載玻片中彼此的相對位置也可以改變那樣。構造的材料也可以寬泛地改變，并且可以是能形成光學清晰窗口的任何材料即不與樣品發(fā)生反應且足夠剛硬以便插入細胞計數(shù)器中的任何材料。聚(甲基丙烯酸脂)和聚碳酸酯是可使用的材料的示例。其它材料對于本領域技術人員而言是顯而易見的。同樣地，上述的板的接合可以是通過常規(guī)手段來實現(xiàn)的。激光焊接和超聲焊接是示例。在本文所附的權利要求書中，術語“一”或“一個”旨在表示“一個或多個”。當描述步驟或元素時，術語“包括”以及諸如“所包括”以及“所包含”等其變體旨在表示另外的步驟或元素的添加是可選的且不是排它性的。本說明書所引用的全部專利、專利申請、以及其它公開的參考材料通過引用整體結合于此。本文所引用的任何參考材料或任何一般的現(xiàn)有技術與本說明書的明確教示之間的任何差異旨在有利地包含在本說明書教示中。其包括詞或短語的該領域所認同的定義以及相同詞或短語的在本說明書所明確提供的定義之間的任何不一致。
權利要求
1.一種自動細胞計數(shù)器，包括光學部件；用于收納樣品載玻片的樣品托板；以及用于保持所述光學部件和樣品托板的外殼，所述光學部件包括光源；數(shù)字成像傳感器；以及透鏡，所述透鏡被放置成引導來自所述光源的光穿過所述樣品托板到達所述數(shù)字成像傳感器，所述光學部件排列在線性光路中，并且被安排成使得當包含細胞懸浮液的樣品載玻片被安裝到所述樣品托板中時，所述細胞懸浮液的圖像被投影到所述數(shù)字成像傳感器上，所述數(shù)字成像傳感器包括至少約4，000, 000個像素并且對樣品托板處的至少3mm2的視場進行成像，每個像素的面積是2X 2 μ m或更小些。
2.如權利要求1所述的自動細胞計數(shù)器，其中，所述數(shù)字成像傳感器包含約4，000, 000到10，000, 000個像素，每個像素的面積約為 0. 5 X 0. 5 μ m 至Ij 2 X 2 μ m，成像的場約為 3mm2 到 10mm2。
3.如權利要求1所述的自動細胞計數(shù)器，其中，所述光路是垂直取向的，并且，所述外殼被安裝到一支撐基座，所述支撐基座至少與所述外殼一樣寬，所述外殼和支撐基座各自占據(jù)的橫向面積不大于300cm2，所述光路的總高度不大于20cm。
4.如權利要求1所述的自動細胞計數(shù)器，其中，所述數(shù)字成像傳感器包括用于產(chǎn)生所述圖像的相鄰區(qū)域之間的對比值的裝置，所述樣品托板具有沿著所述光路的可調節(jié)的高度，所述細胞計數(shù)器還包括用于響應于所述對比值而自動調節(jié)所述高度直到所述圖像被聚焦的裝置。
5.如權利要求4所述的自動細胞計數(shù)器，還包括數(shù)字成像器，用于對所述視場中的細胞進行計數(shù)。
6.如權利要求5所述的自動細胞計數(shù)器，其中，當把樣品載玻片插入到所述樣品托板中時，就自動地啟動所述樣品托板的所述高度的自動調節(jié)以及數(shù)字成像器。
7.如權利要求1所述的自動細胞計數(shù)器，其中，所述數(shù)字成像傳感器是平的，所述透鏡包括消色差透鏡對，所述消色差透鏡對具有在所述數(shù)字成像傳感器處的聚焦場，所述自動細胞計數(shù)器還包括用于校正所述聚焦場的曲率的裝置。
8.如權利要求7所述的自動細胞計數(shù)器，其中，所述用于校正所述聚焦場的曲率的裝置是與所述數(shù)字成像傳感器相鄰的負透鏡。
9.如權利要求1所述的自動細胞計數(shù)器，其中，所述光源是光譜受限的，以在所述成像傳感器中產(chǎn)生一圖像，所述圖像在活細胞和死細胞之間作出區(qū)分。
10.如權利要求1所述的自動細胞計數(shù)器，其中，所述數(shù)字成像傳感器是彩色數(shù)字傳感器。
11.如權利要求3所述的自動細胞計數(shù)器，其中，當所述支撐基座位于一表面上時，所述外殼的高度是30cm或更小并且所述樣品托板是在所述表面上方至少6cm。
12.如權利要求1所述的自動細胞計數(shù)器，還包括質量控制載玻片，所述質量控制載玻片具有用于被安裝到所述樣品托板上的尺寸，并且其上印有圖案以模擬活細胞和死細胞。
13.一種用于對細胞懸浮液中的細胞進行計數(shù)的樣品載玻片，所述樣品載玻片包括具有內(nèi)部腔室的平板，所述內(nèi)部腔室以光學清晰的頂部窗口和底部窗口為界；以及在所述平板中的取向凹口，用于引導所述平板按一種取向進入細胞計數(shù)儀器由此使所述頂部窗口在所述儀器內(nèi)面朝著一選定的方向。
14.如權利要求13所述的樣品載玻片，其中，所述頂部窗口比所述底部窗口薄很多。
15.如權利要求13所述的樣品載玻片，包括單個平板，在所述單個平板中有第一和第二內(nèi)部腔室，所述內(nèi)部腔室在所述平板中橫向地相對于彼此而定位，并且每個內(nèi)部腔室都具有光學清晰的頂部窗口和底部窗口，所述單個平板包括第一和第二取向凹口，用于引導所述平板按取向進入所述細胞計數(shù)儀器，由此使光學清晰的頂部窗口在所述儀器內(nèi)面朝著一選定的方向。
16.一種用于對細胞懸浮液中的細胞進行計數(shù)的方法，所述方法包括(a)將所述細胞懸浮液的等分部分放置在樣品載玻片的內(nèi)部腔室中，以在所述腔室中形成所述懸浮液的薄膜；(b)通過將所述樣品載玻片插入到樣品托板上并將所述樣品托板放置在由光學部件形成的線性光路中，在數(shù)字成像傳感器上產(chǎn)生所述薄膜內(nèi)的至少3_2的視場的數(shù)字圖像，所述數(shù)字成像傳感器包括至少4，000, 000個像素，每個像素的面積是2 X 2 μ m或更小，所述光學部件包括光源、所述數(shù)字成像傳感器和透鏡，所述透鏡被放置成引導來自所述光源的光穿過所述樣品托板到達所述數(shù)字成像傳感器；以及(c)對所述數(shù)字圖像中的細胞進行數(shù)字計數(shù)。
17.如權利要求16所述的方法，其中，所述數(shù)字成像傳感器包含約4，000, 000到10，000, 000個像素，每個像素的面積約為 0. 5 X 0. 5 μ m 至Ij 2 X 2 μ m，成像的場約為 3mm2 到 10mm2。
18.如權利要求16所述的方法，其中，步驟(b)是通過包括下列的多種功能來執(zhí)行的通過移動所述樣品托板，自動地聚焦所述數(shù)字圖像；檢測所述等分部分中是否有活性染色劑；當檢測到活性染色劑時，產(chǎn)生所述樣品載玻片的內(nèi)部腔室中的多個焦平面的數(shù)字圖像；以及處理在所述數(shù)字成像傳感器上所形成的圖像以確定所述等分部分中的細胞計數(shù)，上述多種功能都是在上述外殼內(nèi)執(zhí)行的。
19.如權利要求16所述的方法，其中，所述光路是垂直取向的，并且，所述樣品托板和所述光學部件被保持在一外殼中，所述外殼被安裝到一支撐基座，所述支撐基座至少與所述外殼一樣寬，所述外殼和支撐基座各自占據(jù)的橫向面積不大于300cm2，所述光路的總高度不大于20cm。
20.如權利要求16所述的方法，還包括(a’)自動地產(chǎn)生所述圖像的相鄰區(qū)域之間的對比值，并且，響應于對比值，沿著所述光路將所述樣品托板自動地調節(jié)至一高度以聚焦所述圖像。
21.如權利要求16所述的方法，其中，當把所述樣品載玻片插入到所述樣品托板中時，就自動地啟動步驟(a’ )和(b)。
22.如權利要求16所述的方法，其中，所述數(shù)字成像傳感器是平的，所述透鏡包括消色差透鏡對以及負透鏡，所述消色差透鏡對具有在所述數(shù)字成像傳感器處的聚焦場，所述負透鏡被定位成校正所述聚焦場的曲率。
23.如權利要求16所述的方法，其中，所述光源是光譜受限的，以在所述成像傳感器中產(chǎn)生一圖像，所述圖像在活細胞和死細胞之間作出區(qū)分。
24.如權利要求16所述的方法，還包括用活性染色劑處理所述細胞懸浮液，由此在所述成像傳感器中產(chǎn)生一圖像，所述圖像在活細胞和死細胞之間作出區(qū)分。
25.如權利要求16所述的方法，其中， 所述數(shù)字成像傳感器是彩色數(shù)字傳感器。
26.如權利要求16所述的方法，其中，步驟(c)包括將所述光學部件聚焦到所述內(nèi)部腔室內(nèi)的多個平面上。
全文摘要
在自動細胞計數(shù)器中對液體懸浮液中的生物細胞進行計數(shù)，該計數(shù)器將該懸浮液的圖像聚焦到數(shù)字成像傳感器上，該傳感器包含至少4,000,000像素，每個像素的面積是2×2μm或更小些，并且該傳感器對至少3mm2的視場進行成像。該傳感器能使該計數(shù)器將光學部件壓縮到垂直排布時高度小于20cm的光路中，該光路整體的方向沒有變化，整個儀器的覆蓋區(qū)小于300cm2。通過簡單地將樣品支架插入該儀器中，就啟動了光源的激活、傳感器圖像的自動聚焦和數(shù)字細胞計數(shù)的所有功能。將懸浮液置于載玻片形式的樣品腔室中，該載波片被定形為確保載玻片在細胞計數(shù)器中有恰當?shù)娜∠颉?br> 文檔編號G06K9/00GK102576406SQ201080045726
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月30日 優(yōu)先權日2009年8月31日
發(fā)明者D·Y·楚, D·弗洛里, E·赫夫納, F·沈, M·格里芬, P·帕特, T·麥科勒姆, 衡欣 申請人:生物輻射實驗室股份有限公司