用于檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞基因的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞IGH/FGFR3、GH/CCND1、IGH/MAF、lq21、TP53 基因的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]多發(fā)性骨髓瘤(MM)是以骨髓中克隆性漿細(xì)胞惡性增殖和異常積聚為特征的腫瘤，表現(xiàn)為單克隆免疫球蛋白或輕鏈(M蛋白)過度生成、骨骼破壞、貧血、腎功能受損和免疫功能異常，MM病變?cè)谛螒B(tài)學(xué)上可能是相似的。已在基因和分子學(xué)水平將該病分為幾種亞型，多發(fā)性骨髓瘤患者中已確定的特殊的染色體異常包括異位、缺失或擴(kuò)增，17pl3缺失(腫瘤抑制基因的基因座，P53)可導(dǎo)致TP53基因雜后性丟失，被認(rèn)為是MM的高危特征，其中其他高危的染色體畸變都具有結(jié)構(gòu)性變化的特征，包括涉及位于14q32的IGH基因(編碼免疫球蛋白重鏈)的特殊重排，根據(jù)14q21的易位可將患者分為幾個(gè)亞型，其中三個(gè)主要的亞型為 t (11 ；14) (ql3 ；q32)基因?yàn)?IGH/CCND1、t (4 ；14) (pl6 ；q32)基因?yàn)?IGH/FGFR3、t(14 ；16) (q32 ；q23)基因?yàn)镮GH/MAF。I號(hào)染色體異常也常見于MM染色體變化當(dāng)中，短臂常與缺失相關(guān)，長(zhǎng)臂常與擴(kuò)增相關(guān)，lq21的獲取/擴(kuò)增增加了 MM發(fā)生進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)，復(fù)發(fā)患者存在lq21擴(kuò)增的幾率比新診斷患者要高。
[0003]焚光原位雜交技術(shù)(fluorescentin situ hybridizat1n)，簡(jiǎn)稱FISH，是利用焚光標(biāo)記的特異核酸探針與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號(hào)，來確定與特異探針雜交后被染色的細(xì)胞或細(xì)胞器的形態(tài)和分布，或者是結(jié)合了熒光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其他細(xì)胞器中的定位。目前，常用FISH技術(shù)來檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤，多發(fā)性骨髓瘤患者的腫瘤細(xì)胞在骨髓內(nèi)比例較低且分布不均勻，加之骨髓抽吸過程中會(huì)發(fā)生外周血的稀釋，因此進(jìn)行FISH檢測(cè)時(shí)，常受到正常細(xì)胞的干擾而無法準(zhǔn)確地識(shí)別腫瘤細(xì)胞，當(dāng)骨髓涂片細(xì)胞中漿細(xì)胞比例小于30%，或流式細(xì)胞儀檢測(cè)漿細(xì)胞比例小于10%時(shí)，F(xiàn)ISH檢測(cè)就會(huì)出現(xiàn)假陰性，影響了結(jié)果的準(zhǔn)確判讀。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0004]為了解決上述技術(shù)問題，本實(shí)用新型的目的在于提供用于檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞IGH/FGFR3、GH/CCND1、IGH/MAF、lq21、TP53基因的試劑盒，本實(shí)用新型采用CD138磁珠分選(MACS)可有效的篩選/富集漿細(xì)胞，排除其他細(xì)胞干擾，減少假陰性，提高了檢測(cè)陽性率。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采取的技術(shù)方案是:一種用于檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞IGH/FGFR3、GH/CCND1、IGH/MAF、lq21、TP53基因的試劑盒，包括盒體⑴、盒蓋⑵和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(3)，所述襯墊(3)上設(shè)有小孔，裝有IGH/FGFR3熒光探針的試劑管⑷、裝有IGH/CCND1熒光探針的試劑管(5)、裝有IGH/MAF熒光探針的試劑管(6)、裝有l(wèi)q21熒光探針的試劑管(7)、裝有TP53熒光探針的試劑管(8)、裝有20XSSC洗液的試劑管(9)、裝有NP40裂解液的試劑管(10)、裝有DAPI染色液的試劑管(11)、裝有CD 138免疫磁珠的試劑管(12)、裝有auto MACSTM Running Buffer (自動(dòng)免疫磁珠細(xì)胞分選緩沖液)的試劑管(13)、裝有WholeBlood Column Elut1n Buffer (全血過柱洗脫液)的試劑管(14)、裝有固定液的試劑管(15)和裝有胃蛋白酶的試劑管(16)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。其中，自動(dòng)免疫磁珠細(xì)胞分選緩沖液為購(gòu)買自德國(guó)MiltenyiB1tech公司的auto MACSTMRunning Buffer ;全血過柱洗脫液為購(gòu)買自德國(guó)MiltenyiB1tech公司的WholeBloodColumn Elut1n Buffer。
[0006]其中，上述IGH/FGFR3熒光探針為檢測(cè)IGH/FGFR3基因的常規(guī)探針；上述IGH/CCNDl熒光探針為檢測(cè)IGH/CCND1基因的常規(guī)探針；上述IGH/MAF熒光探針為檢測(cè)IGH/MAF基因的常規(guī)探針；上述lq21熒光探針為檢測(cè)lq21基因的常規(guī)探針；上述TP53熒光探針為檢測(cè)TP53基因的常規(guī)探針。
[0007]其中，所述固定液為冰醋酸與甲醇體積比為1:3的試劑。
[0008]其中，所述20 X SSC洗液、NP40裂解液、DAPI染色液、CD 138免疫磁珠、auto MACSTMRunning Buffer、WholeBlood Column Elut1n Buffer 和胃蛋白酶均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑。
[0009]其中，所述襯墊(3)上設(shè)有13個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊(3)上分成三排平行排列。
[0010]通過以上技術(shù)方案，本實(shí)用新型的有益效果如下:
[0011](I)本實(shí)用新型的試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理，方便攜帶、保存，不易受污染；
[0012](2)采用先⑶138磁珠分選(MACS)篩選/富集漿細(xì)胞，再進(jìn)行FISH檢測(cè)的方法，排除其他細(xì)胞干擾，減少假陰性，提高檢測(cè)陽性率，更有利于患者的及時(shí)診治，滿足了臨床的需求。
【附圖說明】
[0013]圖1為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0014]圖中，1-盒體，2-盒蓋，3-襯墊，4-裝有IGH/FGFR3熒光探針的試劑管，5-裝有IGH/CCND1熒光探針的試劑管，6-裝有IGH/MAF熒光探針的試劑管，7-裝有l(wèi)q21熒光探針的試劑管，8-裝有TP53熒光探針的試劑管，9-裝有20 X SSC洗液的試劑管，10-裝有NP40裂解液的試劑管，11-裝有DAPI染色液的試劑管，12-裝有CD138免疫磁珠的試劑管，13-裝有 auto MACSTM Running Buffer 的試劑管，14-裝有 WholeBlood Column Elut1n Buffer的試劑管，15-裝有固定液的試劑管，16-裝有胃蛋白酶的試劑管。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步描述，本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本實(shí)用新型的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本實(shí)用新型的精神和范圍下可以對(duì)本實(shí)用新型技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本實(shí)用新型的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0016]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0017]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]實(shí)施例用于檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞IGH/FGFR3、GH/CCND1、IGH/MAF、lq21、TP53基因及其使用方法
[0019]如圖1所示，本實(shí)用新型提供了一種用于檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞IGH/FGFR3、GH/CCNDl、IGH/MAF、lq21、TP53基因的試劑盒，包括盒體1、盒蓋2和設(shè)置在盒體I內(nèi)的襯墊3，所述襯墊3上設(shè)有小孔，裝有IGH/FGFR3熒光探針的試劑管4、裝有IGH/CCND1熒光探針的試劑管5、裝有IGH/MAF熒光探針的試劑管6、裝有l(wèi)q21熒光探針的試劑管7、裝有TP53熒光探針的試劑管8、裝有20 X SSC洗液的試劑管9、裝有NP40裂解液的試劑管1、裝有DAPI染色液的試劑管11、裝有CD138免疫磁珠的試劑管12、裝有auto MACSTM Running Buffer的試劑管13、裝有WholeBlood Column Elut1n Buffer的試劑管14、裝有固定液的試劑管15和裝有胃蛋白酶的試劑管16被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。
[0020]其中，上述IGH/FGFR3熒光探針為檢測(cè)IGH/FGFR3基因的常規(guī)探針；上述IGH/CCNDl熒光探針為檢測(cè)IGH/CCND1基因的常規(guī)探針；上述IGH/MAF熒光探針為檢測(cè)IGH/MAF基因的常規(guī)探針；上述lq21熒光探針為檢測(cè)lq21基因的常規(guī)探針；上述TP53熒光探針為檢測(cè)TP53基因的常規(guī)探針。
[0021]其中，所述固定液為冰醋酸與甲醇體積比為1:3的試劑。
[0022]其中，所述20 X SSC洗液、NP40裂解液、DAPI染色液、CD 138免疫磁珠、auto MACSTMRunning Buffer、WholeBlood Column Elut1n Buffer 和胃蛋白酶均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑。
[0023]其中，IGH/FGFR3熒光探針、IGH/CCNDI熒光探針、IGH/MAF熒光探針、TP53熒光探針購(gòu)買自美國(guó)Vysis公司；lq21熒光探針購(gòu)買自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司W(wǎng)D138免疫磁珠購(gòu)買自德國(guó)MiltenyiB1tech公司。
[0024]檢測(cè)步驟如下:
[0025]I)將4mL骨髓樣本離心后棄上清，加入30 μ 1CD138免疫磁珠，再加入auto MACSTMRunning Buffer液至骨髓樣品的初始體積；
[0026]2)4°C孵育 20min，用 Midi MACSTM S印arator 儀器過柱子 3 次，再加入 WholeBloodColumn Elut1n Buffer液從柱子上沖刷下白細(xì)胞，收集到的液體離心后棄上清得到細(xì)胞；
[0027]3)將細(xì)胞用固定液固定后，置于載玻片上，用胃蛋白酶消化，胃蛋白酶消化時(shí)的條件為 65 °C、Ih ；
[0028]4)加入 IGH/FGFR3、IGH/CCND1、IGH/MAF、lq21、TP53 熒光探針，在雜交儀中雜交；
[0029]5)在72°C，使用NP40裂解液輕洗細(xì)胞90s ；
[0030]6)在室溫下放置5min，加DAPI染色液，進(jìn)行鏡檢，每個(gè)基因分析400個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞比例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞基因的試劑盒，其特征在于:包括盒體(1)、盒蓋(2)和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(3)，所述襯墊(3)上設(shè)有小孔，裝有IGH/FGFR3熒光探針的試劑管⑷、裝有IGH/CCND1熒光探針的試劑管(5)、裝有IGH/MAF熒光探針的試劑管(6)、裝有l(wèi)q21熒光探針的試劑管(7)、裝有TP53熒光探針的試劑管(8)、裝有20X SSC洗液的試劑管(9)、裝有NP40裂解液的試劑管(10)、裝有DAPI染色液的試劑管(11)、裝有CD138免疫磁珠的試劑管(12)、裝有自動(dòng)免疫磁珠細(xì)胞分選緩沖液的試劑管(13)、裝有全血過柱洗脫液的試劑管(14)、裝有固定液的試劑管(15)和裝有胃蛋白酶的試劑管(16)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。2.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述固定液為冰醋酸與甲醇體積比為1:3的試劑。3.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述襯墊(3)上設(shè)有13個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊(3)上分成三排平行排列。
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種用于檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞基因的試劑盒，其特征在于：包括盒體、盒蓋和設(shè)置在盒體內(nèi)的襯墊，襯墊上設(shè)有小孔，分別裝有IGH/FGFR3、IGH/CCND1、IGH/MAF、1q21、TP53熒光探針的試劑管，以及分別裝有20×SSC洗液、NP40裂解液、DAPI染色液、CD138免疫磁珠、auto MACSTM Running Buffer、WholeBlood Column Elution Buffer、固定液和裝有胃蛋白酶的試劑管被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。本實(shí)用新型的試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理，方便攜帶、保存，不易受污染，相比較傳統(tǒng)的檢測(cè)方法提高了檢測(cè)陽性率，更有利于患者的及時(shí)診治，滿足了臨床的需求。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號(hào)】CN204630932
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201520364067
【發(fā)明人】鄧勝, 張玉杰, 王桂林, 孫媛, 王妍, 王緒華, 梁超, 陳忠, 方國(guó)偉, 黃士昂
【申請(qǐng)人】北京海思特臨床檢驗(yàn)所有限公司
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年5月29日