伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的檢測方法，包括以下步驟：(1)伊血安顆粒加入甲醇超聲提取制得供試品溶液；(2)供試品溶液經(jīng)高效液相色譜儀檢測，色譜條件：梯度洗脫，紫外檢測波長：0～20min為256nm，20～30min為279nm。本方法對測定條件中的色譜柱、檢測波長、色譜流動相、柱溫以及樣品前處理方法均進行了優(yōu)化，從而保證本方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，可幫助實現(xiàn)伊血安顆粒成品質(zhì)量的有效控制。
【專利說明】
伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物檢測領(lǐng)域，特別是一種伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量 測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 伊血安顆粒是一種治療婦科血癥的中成藥，主要成份為滇桂艾納香、益母草、延胡 索、甘草等，具有活血止血、行氣止痛等功效。臨床上用于產(chǎn)后惡露不絕，人工流產(chǎn)后子宮出 血不凈，中醫(yī)辯證屬血瘀證者。
[0003] 其中君藥滇桂艾納香為瑤族民間草藥，來源于菊科植物滇桂艾納香[Blumea riparia(BL)DC.]的干燥全草，具有活血化瘀、斂血止血等功能;滇桂艾納香是被現(xiàn)代人發(fā) 掘利用的，所以在古籍文獻中都未見有記載，其主要產(chǎn)于云南東南部、廣西西南部及廣東西 南部。目前，國內(nèi)對滇桂艾納香化學(xué)成分的研究報道很少。有研究證實滇桂艾納香中活性成 分原兒茶酸能增大冠脈流量、抑制血小板聚集，具有止咳化痰、抗菌等作用；原兒茶醛具有 擴張冠狀動脈、降低心肌耗氧量、抗氧化、抗炎等作用。國家食品藥品監(jiān)督管理局標準 YBZ00292008中，伊血安顆粒的含量測定方法采用恒速的流動相只測定原兒茶酸的含量，供 試品溶液是采用水飽和正丁醇溶液提取制備;該法對主要有效成分原兒茶酸存在較大的陰 性干擾，測定不準確，不能有效控制成品中原兒茶酸的含量。
[0004] 公布號為CN 104215708 A的專利申請公開了用于治療婦科血癥的中藥復(fù)方顆粒 的含量檢測方法，采用同一色譜條件下同時測定原兒茶酸和原兒茶醛的含量，供試品溶液 經(jīng)甲醇回流提取，在酸性條件用乙醚萃取制得。如此有效消除了陰性干擾，又能提高原兒茶 酸和原兒茶醛的提取率，但該法樣品前處理過程較為復(fù)雜，且梯度洗脫的時間較長，原兒茶 酸在恒定的紫外波長條件下也不能獲得較大的吸收峰。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法，本方法的 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，可幫助實現(xiàn)伊血安顆粒成品質(zhì)量的有效控制，。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0007] -種伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法，其特征在于包括以下步 驟：
[0008] (1)供試品溶液的準備:取伊血安顆粒，加入體積分數(shù)為60~100%甲醇水溶液，超 聲提取30~60min，放冷，采用相同體積分數(shù)的甲醇水溶液補足減失的重量，過濾，取續(xù)濾 液，離心，取上清液，得供試品溶液；
[0009] (2)取供試品溶液經(jīng)高效液相色譜儀檢測，然后計算獲得伊血安顆粒中原兒茶酸 和原兒茶醛的含量。
[0010] 以上所述的步驟(2)中，在計算獲得伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量之 前還包括標準曲線的繪制：
[0011] A.對照品溶液的準備:稱取原兒茶酸對照品和原兒茶醛對照品，加甲醇溶解并定 容，搖勻，制得原兒茶酸對照品溶液和原兒茶醛對照品溶液；
[0012] B.取步驟A制得的對照品溶液，與甲醇混合配制成不同濃度的對照品溶液的標準 工作溶液，取不同濃度的對照品溶液的標準工作溶液，按照與供試品溶液相同的檢測條件 在高效液相色譜儀中進行檢測，得到原兒茶酸和原兒茶醛的標準曲線和線形回歸方程。
[0013] 優(yōu)選的，所述步驟(2)中，高效色相色譜儀的檢測條件為:色譜柱以十八烷基鍵合 硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為甲醇與0.1%的色譜用冰乙酸組成的梯度洗脫液，柱 溫20~35°C，流速為0.8~1.2mL ? min-1;所述梯度洗脫的程序設(shè)為時間梯度0min-9min4 19min420min-30min，對應(yīng)的梯度洗脫液按以下體積比由流動相A甲醇和流動相BO. 1 %冰 乙酸組成，流動相A的體積百分數(shù)梯度8 - 流動相B的體積百分 數(shù)梯度92%491%490%486%-85%;紫外檢測波長：0~2〇111111為25611111，20~3〇111111為 279nm〇
[0014]優(yōu)選的，所述步驟（1)中，稱取5g伊血安顆粒，加入15mL體積分數(shù)為60~100%甲醇 水溶液進行超聲提取;更優(yōu)選的，所述步驟(1)中，甲醇水溶液的體積分數(shù)為80 %。
[0015] 優(yōu)選的，所述步驟(1)中，超聲提取的時間為45min。
[0016] 優(yōu)選的，所述步驟(2)中，流速為lmL ? mirT1。
[0017]優(yōu)選的，所述步驟(2)中，柱溫為25°C。
[0018] 優(yōu)選的，所述步驟(2)中，色譜柱為Phenomenex Gemini C18柱，采用的保護柱為 Phenomenex Cis柱。
[0019]優(yōu)選的，所述步驟(2)中，色譜柱的理論塔板數(shù)按原兒茶酸和原兒茶醛峰計不低于 5000 〇
[0020]本發(fā)明中，所述甲醇水溶液的體積分數(shù)是指含甲醇的體積分數(shù)。
[0021]以上所述的高效液相色譜測定伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛含量的方法，具 有以下優(yōu)點：
[0022] (1)采用甲醇為提取溶劑對伊血安顆粒進行超聲提取，可使伊血安顆粒的有效物 質(zhì)完全溶解于提取溶劑，且在提取的過程簡單快捷，易于操作；
[0023] (2)以甲醇和0.1%冰乙酸組成的梯度洗脫液作為流動相，能對供試品中不同極性 的物質(zhì)進行有效地分離，且縮短了分析時間，減少了流動相的消耗；
[0024] (3)根據(jù)原兒茶酸和原兒茶醛的最大吸收波長不同，在檢測過程中轉(zhuǎn)換紫外檢測 波長，可實現(xiàn)在同時測定原兒茶酸和原兒茶醛含量時，原兒茶酸和原兒茶醛均能獲得較好 的吸收峰；
[0025] (4)本方法對測定條件中的色譜柱、檢測波長、色譜流動相、柱溫以及樣品前處理 方法均進行了優(yōu)化，從而保證本方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，可幫助實現(xiàn)伊血安顆粒成品 質(zhì)量的有效控制，確保臨床使用療效，為伊血安顆粒的療效穩(wěn)定確切提供了可靠保障。
【附圖說明】
[0026] 圖1是實施例1中采用Welchrom C18柱(4.6mmX250mm，5wii)得到的色譜圖；
[0027] 圖2是實施例1中采用Hypersil C18柱(4.6mmX250mm，5iim)得到的色譜圖；
[0028] 圖3是實施例1 中米用Phenomenex Gemini C18柱（4.6mmX250mm，5iim)得到的色譜 圖；
[0029] 圖4是實施例1中采用乙腈-水為流動相得到的色譜圖；
[0030] 圖5是實施例1中采用乙腈-0.1 %冰乙酸為流動相得到的色譜圖；
[0031 ]圖6是實施例1中采用甲醇-水為流動相得到的色譜圖；；
[0032]圖7是實施例1中采用甲醇-0.1%冰乙酸為流動相得到的色譜圖；
[0033]圖8是實施例1中流速為0.8mL ? min-1得到的色譜圖；
[0034]圖9是實施例1中流速為l.OmL ? min-1得到的色譜圖；
[0035]圖10是實施例1中流速為1.2mL ? min-1得到的色譜圖；
[0036]圖11是實施例1中柱溫為20°C得到的色譜圖；
[0037]圖12是實施例1中柱溫為25°C得到的色譜圖；
[0038]圖13是實施例1中柱溫為30°C得到的色譜圖；
[0039] 圖14是實施例1中柱溫為35°C得到的色譜圖；
[0040] 圖15是實施例1中波長為256nm得到的色譜圖；
[0041] 圖16是實施例1中波長為279nm得到的色譜圖；
[0042] 圖17是實施例1中波長為256nm(0~20min)-279nm(20~30min)得到的色譜圖；
[0043] 圖18是實施例2中以甲醇為提取溶劑提取后檢測得到的色譜圖；
[0044] 圖19是實施例2中以乙醇為提取溶劑提取后檢測得到的色譜圖；
[0045] 圖20是實施例2中以水為提取溶劑提取后檢測得到的色譜圖；
[0046] 圖21是實施例2中提取第一次時提取液檢測得到的色譜圖；
[0047] 圖22是實施例2中提取第二次時提取液檢測得到的色譜圖；
[0048] 圖23是實施例3中原兒茶酸的標準工作曲線；
[0049] 圖24是實施例3中原兒茶醛的標準工作曲線；
[0050] 圖25是實施例4中原兒茶酸和原兒茶醛對照品溶液的色譜圖；
[0051]圖26是實施例4中供試品溶液的色譜圖；
[0052]圖27是實施例4中陰性對照溶液的色譜圖；
[0053] 1-原兒茶酸吸收峰，2-原兒茶醛吸收峰。
【具體實施方式】
[0054]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于以下實 施例：
[0055]實施例1:色譜儀條件的優(yōu)化
[0056]供試品溶液的準備方法:取伊血安顆粒5g，置具塞錐形瓶，加入體積分數(shù)為80 %甲 醇水溶液15mL，超聲提取45min，放冷，采用體積分數(shù)為80%甲醇水溶液補足減失的重量，過 濾，取續(xù)濾液，離心，取上清液，得供試品溶液。
[0057] 1-1色譜柱的選擇
[0058] 高效液相色譜儀的其他測定條件相同，考察了Welchrom C18柱(4.6mmX 250mm，5ii m)、Hypersil C18柱（4.6mmX250mm，5iim)和Phenomenex Gemini C18柱（4.6mmX250mm，5ii m)三種色譜柱，所得到的色譜圖分為如圖1、圖2、圖3所示，由圖3可以看出，Phenomenex Gemini C18柱(4.6mmX250mm，5ym)分離度最好，峰形對稱和尖銳，保留時間適中。
[0059] 1-2流動相的選擇
[0060]高效液相色譜儀的其他測定條件相同，考察了乙腈-水、乙腈-0.1%冰乙酸、甲醇-水、甲醇-0.1%冰乙酸為流動相進行梯度洗脫，所得到的色譜圖分別如圖4、圖5、圖6、圖7所 示，經(jīng)比較可以看出，以甲醇-0.1%冰乙酸系統(tǒng)為流動相的色譜圖吸收峰分離較好。
[0061 ] 1-3流速的選擇
[0062]高效液相色譜儀的其他測定條件相同，考察了0.8mL ? mirT^l .OmL ? mirT1、 不同流速，所得到的色譜圖分別如圖8、圖9、圖10所示，經(jīng)比較可以看出，色譜 圖的吸收峰均可較好地被分離，但以流速為1 .OmL ? mirT1的色譜圖吸收峰分離最好，保留時 間適中。
[0063] 1-4柱溫的選擇
[0064]高效液相色譜儀的其他測定條件相同，考察了柱溫20°(：、25°(：、30°(：、35°(：，所得到 的色譜圖分別如圖11、圖12、圖13、圖14所示，經(jīng)比較可以看出，色譜圖的吸收峰均可較好地 被分離，但以柱溫25 °C時出現(xiàn)的色譜峰對稱性最好，且出峰時間適宜，分離度最好。
[0065] 1-5檢測波長的選擇
[0066]高效液相色譜儀的其他測定條件相同，考察了波長256nm、279nm、256nm(0~ 20min)-279nm(20~30min)，所得到的色譜圖分別如圖15、圖16、圖17所示，1為原兒茶酸的 吸收峰，2為原兒茶醛的吸收峰，經(jīng)比較可以看出，256nm(0~20min)-279nm(20~30min)可 使原兒茶酸和原兒茶醛均能獲得較好的吸收峰。
[0067]實施例2:樣品前處理方法的優(yōu)化
[0068] 高效液相色譜儀的色譜條件為:色譜柱采用Phenomenex Gemini C18柱(4.6mmX 250mm，5iim)，保護柱采用Phenomenex C18(4X3.0mm)，梯度洗脫，流動相為甲醇與0? 1%的 色譜用冰乙酸組成的梯度洗脫液，柱溫25°C，流速為1.OmL ? mirT1;所述梯度洗脫的程序設(shè) 為時間梯度0min49min4l9min420min430min，對應(yīng)的梯度洗脫液按以下體積比由流動 相A甲醇和流動相B0.1 %冰乙酸組成，流動相A的體積百分數(shù)梯度8 %-9% -10% -14% - 15%，流動相8的體積百分數(shù)梯度92%491%490%486%-85%;紫外檢測波長：0~ 20min為256nm，20~30min為279nm。
[0069] 2-1提取溶劑的選擇
[0070]選用甲醇、乙醇和水三種提取溶劑，采用相同的提取方法對伊血安顆粒進行提取， 獲得的提取液通過高效液相色譜儀進行檢測，所得到的色譜圖分別如圖18、圖19、圖20所 示，經(jīng)比較可以看出，用甲醇提取峰形好，基線平穩(wěn)。
[0071] 2-2提取溶劑濃度的選擇
[0072] 提取溶劑按照體積分數(shù)進行配比，選用60 %甲醇水溶液、80 %甲醇水溶液和100 % 甲醇三種提取溶劑，采用相同的提取方法對伊血安顆粒進行提取，獲得的提取液通過高效 液相色譜儀進行檢測，根據(jù)色譜圖計算峰面積，結(jié)果見表1。
[0073]表1提取溶劑濃度考察表
[0074]
[0075]
[0076] 由表1可見，以80%甲醇水溶液為提取溶劑時，樣品有效物質(zhì)完全溶解。
[0077] 2-3提取溶劑用量的選擇
[0078] 取伊血安顆粒5g，分別加入體積分數(shù)為80%的甲醇水溶液15mL、20mL、25mL溶解伊 血安顆粒，采用相同的提取方法對伊血安顆粒進行提取，獲得的提取液通過高效液相色譜 儀進行檢測，根據(jù)色譜圖計算峰面積，結(jié)果見表2。
[0079]表2提取溶劑用量考察表
[0080]
[00811 由表2可見，以提取溶劑用量為15mL時，提取出來的指標成分含量最高。^
[0082] 2-4提取時間的考察
[0083]取伊血安顆粒5g，加入體積分數(shù)為80 %的甲醇水溶液15mL溶解伊血安顆粒，分別 超聲提取3〇1^11、451^11、6〇1^11，獲得的提取液通過高效液相色譜儀進行檢測，根據(jù)色譜圖計 算峰面積，結(jié)果見表3。
[0084]表3提取時間考察表
[0085]
[0086]由表3可見，原兒茶酸和原兒茶醛的含量相差不大，為提取完全，提取時間以45min 為最佳。
[0087] 2-5提取次數(shù)的考察
[0088]取伊血安顆粒5g，加入體積分數(shù)為80%的甲醇水溶液15mL溶解伊血安顆粒，超聲 提取45min，分別提取第1次、提取第2次，獲得的提取液通過高效液相色譜儀進行檢測，獲得 的色譜圖分別見圖21、圖22,由圖22可見，提取1次已基本將原兒茶酸和原兒茶醛提取完全。
[0089] 實施例3伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛含量的測定
[0090] 3-1 供試品溶液的準備：對 10 個批號（120203、120302、120303、120602、120603、 120701、120702、120801、120802、120803)伊血安顆粒進行檢測，每個批號取樣4個；分別稱 取伊血安顆粒5g，置具塞錐形瓶，精密加入80%甲醇水溶液1511^，超聲提取45111111，放冷， 80%甲醇水溶液補足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，離心，取上清液，得供試品溶液。
[0091] 3-2對照品溶液的制備
[0092] 精密稱取原兒茶酸對照品10.04mg和原兒茶醛對照品2.58mg置25mL容量瓶中，加 入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制得濃度為〇.4016mg ? ml/1的原兒茶酸對照品溶液和 0.1032mg ? mL-1的原兒茶醛對照品溶液。
[0093] 3-3標準曲線的制作
[0094] 精密吸取4 ? 1 項下對照品溶液0 ? 2mL、0 ? 4mL、0 ? 6mL、0 ? 8mL、1 ? OmL、1 ? 2mL、1 ? 4mL、 1.6mL分別置于lOmL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，分別吸取上述8個不同濃度的對 照品溶液10yL注入高效液相色譜儀，色譜條件為:色譜柱采用Phenomenex Gemini C18柱 (4 ? 6mmX 250mm，5wii)，保護柱采用Phenomenex C18(4 X 3 ? 0mm)，梯度洗脫，流動相為甲醇與 0.1 %的色譜用冰乙酸組成的梯度洗脫液，柱溫25°C，流速為1. OmL ? mirT1;所述梯度洗脫的 程序設(shè)為時間梯度0min49min4l9min420min430min，對應(yīng)的梯度洗脫液按以下體積比 由流動相A甲醇和流動相B0.1%冰乙酸組成，流動相A的體積百分數(shù)梯度- 14% - 15%，流動相B的體積百分數(shù)梯度92% -91 % -90% -86% -85% ;紫外檢測波長:0 ~20min為256nm，20~30min為279nm;以原兒茶酸和原兒茶醛峰計，理論塔板數(shù)應(yīng)均不低于 5000 〇
[0095] 以對照品溶液濃度X(yg ? ml/1)為橫坐標，其色譜峰峰面積Y為縱坐標，繪制標準工 作曲線，計算回歸方程。
[0096] 原兒茶酸的回歸方程式為Y = 37.3851X-9.5612，r = 0.99998;結(jié)果表明原兒茶酸 對照品進樣量在0.0803~0.6426yg之間與峰面積呈良好線性關(guān)系，結(jié)果見表4，標準工作曲 線見圖23。
[0097]表4原兒茶酸標準工作曲線測定結(jié)果
[0099] 原兒茶醛的回歸方程式為Y = 40.4635X-4.0935，r = 0.99996;結(jié)果表明原兒茶醛 對照品進樣量在0.0206~0.1651yg之間與峰面積呈良好線性關(guān)系，結(jié)果見表5,標準工作曲 線見圖24。
[0100]表5原兒茶醛標準工作曲線測定結(jié)果

[0102] 3-4伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定
[0103] 取供試品溶液經(jīng)高效液相色譜儀檢測，高效液相色譜儀的色譜條件與步驟3-3相 同，然后根據(jù)原兒茶酸和原兒茶醛的標準曲線計算獲得伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛 的含量。檢測結(jié)果見表6。
[0104] 表6 10個批號伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛含量的測定結(jié)果

[0107] 實施例4本發(fā)明含量檢測方法的方法學(xué)研究
[0108] 4-1對照品溶液的準備
[0109] 精密稱取原兒茶酸對照品10.04mg和原兒茶醛對照品2.58mg置25mL容量瓶中，加 入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制得濃度為〇.4016mg ? ml/1的原兒茶酸對照品溶液和 0.1032mg ? mL-1的原兒茶醛對照品溶液。
[0110] 4-2供試品溶液的準備
[0111] 稱取伊血安顆粒5g，置具塞錐形瓶，精密加入80 %甲醇水溶液15mL，超聲提取 45min，放冷，80%甲醇補足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，離心，取上清液，得供試品溶液。
[0112] 4-3缺滇桂艾納香陰性對照溶液
[0113]稱取無滇桂艾納香的伊血安顆粒5g，置具塞錐形瓶，精密加入80 %甲醇15mL，超聲 提取45min，放冷，80 %甲醇水溶液補足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，離心，取上清液，得缺 滇桂艾納香陰性對照溶液。
[0114] 4-4專屬性實驗
[0115] 精密吸取原兒茶酸和原兒茶醛對照品溶液、伊血安顆粒供試品溶液以及缺滇桂艾 納香陰性對照溶液各1〇此進樣分析，結(jié)果見圖25、圖26、圖27。原兒茶酸和原兒茶醛與各自 相鄰峰的分離度>1.5。
[0116] 4-5線性關(guān)系考察
[0117] 本實驗方法與實施例3中的3-3相同，結(jié)果表明，原兒茶酸和原兒茶醛對照品的進 樣量與峰面積之間呈良好線性關(guān)系。
[0118] 4-6精密度考察
[0119] 取同一供試品溶液(批號：120303 )，精密吸取供試品溶液1 OyL，注入高效液相色譜 儀，按實施例3中3-3的色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定供試品中原兒茶酸和原兒茶醛的峰面 積。結(jié)果見表7和表8。
[0120] 表7原兒茶酸精密度實驗結(jié)果(n = 6)
[0122]表8原兒茶醛精密度實驗結(jié)果(n = 6)
[0125] 由結(jié)果可知，測得供試品中原兒茶酸的平均含量為0.1191mg ? g-1，RSD值為 1.76%，原兒茶醛的平均含量為0.0356mg ? g-1，RSD值為2.65%，結(jié)果表明，所使用的高效 液相色譜儀的精密度良好。
[0126] 4-7穩(wěn)定性實驗
[0127] 取同一供試品溶液(伊血安顆粒批號：120303)，室溫下保存，分別在0、2、4、8、16、 24h精密吸取供試品溶液10yL，注入高效液相色譜儀，按實施例3中3-3的色譜條件測定，考 察其穩(wěn)定性。結(jié)果見表9、表10。
[0128] 表9原兒茶酸穩(wěn)定性實驗結(jié)果(n = 6)
[0130]表10原兒茶醛穩(wěn)定性實驗結(jié)果(n = 6)
[0133] 由結(jié)果可知，測得供試品中原兒茶酸的平均含量為0. 1222mg ? g<，RSD值為 1.05%，原兒茶醛的平均含量為0.0375mg ? g-1，RSD值為2.04%，表明供試品溶液在24h內(nèi)保 持穩(wěn)定。
[0134] 4-8重復(fù)性實驗
[0135] 取同一供試品溶液(伊血安顆粒批號：120303)，精密吸取供試品溶液10此，按實施 例3中3-3的色譜條件測定，結(jié)果見表11、表12,測得供試品中原兒茶酸的平均含量為 0.1267mg ? g-l，RSD值為 1.19%，原兒茶醛的平均含量為0.0378mg ? g-l，RSD值為 1.33%， 結(jié)果表明用上述方法測定原兒茶酸和原兒茶醛的含量，重復(fù)性良好。
[0136] 表11原兒茶酸重復(fù)性實驗結(jié)果(n = 6)
[0138] 表12原兒茶醛重復(fù)性實驗結(jié)果(n = 6)[0139]
[0140] 4-9加樣回收率實驗
[0141] 取已知含量的供試品（批號：120303)2.5g，精密稱定9份，分成3組每組3份，第1組 精密加入14 m L 8 0 %甲醇水溶液，精密加入1 m L的混標溶液A (原兒茶酸對照品濃度為 0.253mg ? mL-\原兒茶醛對照品濃度為0.076mg ? mL-第2組精密加入14mL 80%甲醇，精 密加入lmL的混標溶液B(原兒茶酸對照品濃度為0.317mg ? ml/1、原兒茶醛對照品濃度為 0.094mg ? mL-〇 ;第3組精密加入14mL 80 %甲醇，精密加入lmL的混標溶液C(原兒茶酸對照 品濃度為〇.382mg ? ml/1、原兒茶醛對照品濃度為0.114mg ? ml/1);原兒茶酸和原兒茶醛對 照品的加入量分別為供試品含量的80%、100%和120%。按4-2的供試品準備方法制備，分 別測定含量，計算加樣回收率(伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量以〇.1267mg ? g一1 和0.0378mg ? g-1計）。實驗結(jié)果見表13、表14。
[0142] 表13原兒茶酸加樣回收率實驗結(jié)果
[0144]表14原兒茶醛加樣回收率實驗結(jié)果
[0147]由結(jié)果可知，原兒茶酸和原兒茶醛的平均加樣回收率分別為99.78% (RSD = 2.47%)和99.47% (RSD = 1.94%)。
【主權(quán)項】
1. 一種伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法，其特征在于包括以下步 驟： (1) 供試品溶液的準備:取伊血安顆粒，加入體積分數(shù)為60~100 %甲醇水溶液，超聲提 取30~60min，放冷，采用相同體積分數(shù)的甲醇水溶液補足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，離 心，取上清液，得供試品溶液； (2) 取供試品溶液經(jīng)高效液相色譜儀檢測，然后計算獲得伊血安顆粒中原兒茶酸和原 兒茶醛的含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法，其特征 在于： 所述步驟(2)中，高效色相色譜儀的檢測條件為:色譜柱以十八烷基鍵合硅膠為填料， 采用梯度洗脫，流動相為甲醇與〇. 1%的色譜用冰乙酸組成的梯度洗脫液，柱溫20~35°C， 流速為0.8~1.2mL · min-S所述梯度洗脫的程序設(shè)為時間梯度0min49min4l9min-20min -30min，對應(yīng)的梯度洗脫液按以下體積比由流動相A甲醇和流動相BO. 1 %冰乙酸組成，流 動相A的體積百分數(shù)梯度8 % -9 % - 10 % - 14 % - 15 %，流動相B的體積百分數(shù)梯度92 % - 91%-90%-86%-85% ;紫外檢測波長：0~20min為256nm，20~30min為279nm。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法，其特征 在于： 所述步驟（1)中，稱取5g伊血安顆粒，加入15mL體積分數(shù)為60~100 %甲醇水溶液進行 超聲提取。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法，其特征 在于： 所述步驟(2)中，在計算獲得伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量之前還包括標 準曲線的繪制： A. 對照品溶液的準備:稱取原兒茶酸對照品和原兒茶醛對照品，加甲醇溶解并定容，搖 勻，制得原兒茶酸對照品溶液和原兒茶醛對照品溶液； B. 取步驟A制得的對照品溶液，與甲醇混合配制成不同濃度的對照品溶液的標準工作 溶液，取不同濃度的對照品溶液的標準工作溶液，按照與供試品溶液相同的檢測條件在高 效液相色譜儀中進行檢測，得到原兒茶酸和原兒茶醛的標準曲線和線形回歸方程。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法，其特征 在于： 所述步驟(1)中，甲醇水溶液的體積分數(shù)為80 %。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法，其特征 在于： 所述步驟（1)中，超聲提取的時間為45min。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法，其特征 在于： 所述步驟(2)中，流速為lmL · mirT1。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法，其特征 在于： 所述步驟(2)中，柱溫為25°C。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法，其特征 在于： 所述步驟(2)中，色譜柱為Phenomenex Gemini C18柱，采用的保護柱為Phenomenex Ci8 柱。10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的伊血安顆粒中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定方法，其特征 在于： 所述步驟(2)中，色譜柱的理論塔板數(shù)按原兒茶酸和原兒茶醛峰計不低于5000。
【文檔編號】G01N30/02GK106053624SQ201610317105
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】李修善, 慕麗群, 毛金玲, 農(nóng)常東
【申請人】廣西萬壽堂藥業(yè)有限公司