一種母乳中左乙拉西坦的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種母乳中左乙拉西坦的檢測(cè)方法，包括以下步驟：(1)供試品制備：取供試母乳，加入供試母乳5倍體積的乙酸乙酯混勻，離心，取乙酸乙酯層，吹干，復(fù)溶，作為供試品；(2)檢測(cè)：取步驟(1)的供試品用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：固定相：C18色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-無機(jī)鹽溶液，二者的體積比為17:83，所述無機(jī)鹽溶液的pH為4.5；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。本發(fā)明方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)母乳中左乙拉西坦，并且檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可用于臨床檢測(cè)母乳中左乙拉西坦的濃度，為服用左乙拉西坦的哺乳期婦女喂母乳提供指導(dǎo)。
【專利說明】
-種母乳中左乙拉西坦的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物藥物分析領(lǐng)域，具體設(shè)及一種母乳中左乙拉西坦的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 左乙拉西坦（levetiracetam，LEV,商品名KePPra)是新一代抗癒痛藥物，屬化 咯燒酬衍生物。化咯燒酬類促智藥屬于五元雜環(huán)內(nèi)獻(xiàn)胺類促智藥，可視為丫-氨基下酸 (GABA)的衍生物，對(duì)參與神經(jīng)保護(hù)和記憶過程的受體具有特殊作用，是目前最引人注目的 一類促智藥，具有廣譜、起效迅速的抗癒痛活性，藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性較理想、耐受性和安 全性好，特別適用于成人和兒童的難治性部分性發(fā)作的輔助治療。左乙拉西坦的結(jié)構(gòu)與作 用機(jī)制均與其他抗癒痛藥物不同，它的藥代動(dòng)力學(xué)與給藥劑量呈線性關(guān)系，生物利用度能 達(dá)到100%，不具備肝藥酶誘導(dǎo)效應(yīng)，大約91%的劑量能通過腎臟排泄；而且可W通過監(jiān)控 血漿中LEV的濃度來優(yōu)化治療效果，特別對(duì)于有腎損傷的病人或者小孩具有良好的效果， 且不良反應(yīng)小，LEV于2000年經(jīng)FDA獲準(zhǔn)在美國(guó)上市，2007年3月10日在中國(guó)上市（商品 名開浦蘭）。
[0003] 由于上述優(yōu)點(diǎn)，該藥物成了全世界妊娠期女性常用的抗癒痛藥物。然而，因哺乳期 婦女服用左乙拉西坦W后，母乳中是否含有左乙拉西坦W及含有的左乙拉西坦?jié)舛染磺?楚，導(dǎo)致很多服用左乙拉西坦的癒痛女性不敢給孩子喂母乳，最后只能直接選擇奶粉喂養(yǎng)， 增加了癒痛患者家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，最重要的是奶粉不含母乳所含的所有免疫成分，而且奶 粉喂養(yǎng)也不能替代母乳喂養(yǎng)在培養(yǎng)親子感情方面的重要作用。因此，有效檢測(cè)母乳中的左 乙拉西坦具有重要意義。
[0004] 但是，目前尚沒有關(guān)于檢測(cè)母乳中左乙拉西坦方法的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了一種母乳中左乙拉西坦的檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明提供了一種母乳中左乙拉西坦的檢測(cè)方法：它是采用高效液相色譜法進(jìn)行 檢測(cè)，包括W下步驟：（1)供試品制備：取供試母乳，加入供試母乳5倍體積的乙酸乙醋混 勻，離屯、，取乙酸乙醋層，吹干，復(fù)溶，作為供試品；（2)檢測(cè)：取步驟（1)的供試品用高效液 相色譜進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：固定相：C18色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-無機(jī)鹽溶液，二者的體 積比為17:83,所述無機(jī)鹽溶液的抑為4. 5 ;檢測(cè)波長(zhǎng)：210皿。
[0007] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述檢測(cè)方法是定量檢測(cè)方法，步驟如下：a、供試品制備：取供試 母乳，加入1/9倍體積的對(duì)乙酷氨基酪標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻，得內(nèi)標(biāo)供試母乳，再加入內(nèi)標(biāo)供 試母乳5倍體積的乙酸乙醋混勻，離屯、，取乙酸乙醋層，吹干，復(fù)溶，作為供試品；b、標(biāo)準(zhǔn)品 制備：取空白母乳，加入1/8倍體積的左乙拉西坦標(biāo)準(zhǔn)品溶液和1/8倍體積的對(duì)乙酷氨基酪 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻，得標(biāo)樣母乳，再加入標(biāo)樣母乳5倍體積的乙酸乙醋，混勻，離屯、，取乙酸 乙醋層，吹干，復(fù)溶，作為標(biāo)準(zhǔn)品；C、檢測(cè)：取步驟a的供試品和步驟b的標(biāo)準(zhǔn)品，用高效液 相色譜進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：固定相：C18色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-無機(jī)鹽溶液，二者的體 積比為17:83,所述無機(jī)鹽的溶液的抑為4. 5 ;檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm ;d、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算供 試品中左乙拉西坦的含量。 陽OO引進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟a或步驟b中，對(duì)乙酷氨基酪標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為10 y g/mL。
[0009] 母乳：是產(chǎn)后女性乳房產(chǎn)生的用作哺育嬰兒的汁液。
[0010] 空白母乳：是指來自于未服用左乙拉西坦婦女的母乳。
[0011] 進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（1)、步驟a或步驟b中，離屯、的轉(zhuǎn)速是4000r/min，離屯、的時(shí) 間為IOmin。
[0012] 進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（1)、步驟a或步驟b中，吹干是在50°C條件下用氮?dú)獯蹈伞?br>[0013] 進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（1)、步驟a或步驟b中，復(fù)溶是采用步驟（2)中的流動(dòng)相復(fù) 溶。
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（2)或步驟C中，所述C18色譜柱的規(guī)格為150mmX4. 6mm，填 料粒徑為5ym。
[001引進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟似或步驟C中，所述流動(dòng)相中，無機(jī)鹽溶液是濃度為 0.0 lmol/L的憐酸二氨鐘溶液。
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（2)或步驟C中，流動(dòng)相的流速1. 0血/min。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（2)或步驟C中，檢測(cè)的柱溫為30°C。
[0018] 高效液相色譜是檢測(cè)領(lǐng)域常用的檢測(cè)方法，但是由于母乳本身的成分復(fù)雜，干擾 雜質(zhì)多，會(huì)干擾左乙拉西坦的測(cè)定，而且左乙拉西坦在母乳中的代謝產(chǎn)物也會(huì)干擾左乙拉 西坦的測(cè)定，另外，由于母乳中左乙拉西坦的濃度低，不易富集，檢測(cè)難度大。
[0019] 本發(fā)明通過特定的前處理方法與特定高效液相色譜檢測(cè)條件的結(jié)合，達(dá)到了準(zhǔn)確 檢測(cè)母乳中左乙拉西坦的目的，并且，本發(fā)明方法快速簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性 好，可用于臨床檢測(cè)母乳中左乙拉西坦的濃度，為服用左乙拉西坦的哺乳期婦女喂母乳提 供指導(dǎo)。
[0020] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0021] W下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明試驗(yàn)例1空白母乳的高效液相色譜圖。
[0023] 圖2為本發(fā)明試驗(yàn)例1標(biāo)樣母乳的高效液相色譜圖。
[0024] 圖3為本發(fā)明試驗(yàn)例1供試母乳的高效液相色譜圖。
[0025] 圖4為按本發(fā)明試驗(yàn)例2方法所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。 陽0%] 圖5為本發(fā)明試驗(yàn)例5拉莫=嗦的高效液相色譜圖。
[0027] 圖6為本發(fā)明試驗(yàn)例5奧卡西平的高效液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過購(gòu)買市售產(chǎn)品獲 得。具體如下：實(shí)驗(yàn)材料：左乙拉西坦標(biāo)準(zhǔn)品：12-YM-175-1, Toronto Research Qiemicals Inc ;甲醇：分析純（20120921)，成都市科龍化工試劑廠；憐酸二氨鐘：分析純（20091010)， 成都市科龍化工試劑廠；乙酸乙醋：分析純（20120414)，成都市科龍化工試劑廠。主要實(shí)驗(yàn) 儀器：高效液相色譜儀：LC-20AB，日本島津公司；紫外掃描儀：UV-VIS282PC，Unico儀器有 限公司。供試母乳來自服用了左乙拉西坦婦女的母乳。
[0029] 實(shí)施例1本發(fā)明定量檢測(cè)方法
[0030] (1)供試品的制備：取供試母乳180 y L，置于1. 5血離屯、管中，加入濃度為10 y g/ 血的對(duì)乙酷氨基酪標(biāo)準(zhǔn)液20 y以旋滿混合20s，作為內(nèi)標(biāo)供試母乳。向上述內(nèi)標(biāo)供試母乳 中加入1血乙酸乙醋，旋滿混合20s，4000;r/min離屯、lOmin，吸取上層乙酸乙醋層于1. 5血 離屯、管中，在50°C水浴下用氮?dú)獯蹈桑尤?00 y L流動(dòng)相后旋滿混合20s，作為供試品。 陽〇3U 似標(biāo)準(zhǔn)品的制備：取空白母乳160化，置于1.5血離屯、管中，加入濃度為IOii g/ 血的對(duì)乙酷氨基酪標(biāo)準(zhǔn)液20 y L，再分別加入濃度為10,20,40,100,200和400 y g/mL左 乙拉西坦標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 y L旋滿混合20s，使左乙拉西坦?jié)舛确謩e為1，2,4,10,20,40 y g/ mU作為標(biāo)樣母乳。向該標(biāo)樣母乳中加入ImL乙酸乙醋，旋滿混合20s，4000;r/min離屯、 lOmin，吸取上層乙酸乙醋層于1.5血離屯、管中，在50°C水浴下用氮?dú)獯蹈?，加入IOOy L流 動(dòng)相后旋滿混合20s，作為標(biāo)準(zhǔn)品。 陽0巧 做分別取供試品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣量為20化，色譜條件如下：色譜柱為 Diamonsil C18 巧 Jim 150mmX4.6mm)，流動(dòng)相為甲醇-憐酸二氨鐘化 01mol/LpH4.5) (17:83)，等度洗脫；柱溫為30°C ;流速為1血/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為210皿。
[0033] (4)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：X軸為左乙拉西坦和對(duì)乙酷氨基酪的峰面積比，Y軸為左乙拉 西坦和對(duì)乙酷氨基酪的濃度比；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算供試母乳中左乙拉西坦的含量。
[0034] 實(shí)施例2本發(fā)明定性檢測(cè)方法 陽03引 （1)供試品的制備：取供試母乳200化，置于1. 5血離屯、管中，加入1血乙酸乙醋， 旋滿混合20s，4000r/min離屯、lOmin，吸取上層乙酸乙醋層于1. 5血離屯、管中，在50°C水浴 下用氮?dú)獯蹈?，加?00 y L流動(dòng)相后旋滿混合20s，作為供試品。
[0036] (2)取供試品進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣量為20 iiL色譜條件如下：色譜柱為Diamonsil C18 巧 ym 150mmX4. 6mm)，流動(dòng)相為甲醇-憐酸二氨鐘 〇). Olmol/L，pH4. 5)(17:8：3)，等度 洗脫；柱溫為30°C ;流速為1血/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為210皿。
[0037] 為進(jìn)一步說明本發(fā)明方法的有益效果，本發(fā)明提供W下試驗(yàn)例。
[003引試驗(yàn)例1系統(tǒng)適用性和專屬性實(shí)驗(yàn)
[0039] 取空白母乳、加入了內(nèi)標(biāo)物對(duì)乙酷氨基酪和左乙拉西坦（濃度10 y g/mL)標(biāo)準(zhǔn)品 的標(biāo)樣母乳和加入內(nèi)標(biāo)物對(duì)乙酷氨基酪的內(nèi)標(biāo)供試母乳，按實(shí)施例1的方法測(cè)定，所得色 譜圖分別如圖1、圖2、圖3所示。可W看出，內(nèi)標(biāo)物對(duì)乙酷氨基酪和左乙拉西坦的出峰時(shí)間 分別為8. 612min、ll. 844min，對(duì)乙酷氨基酪和左乙拉西坦完全分離，且無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾， 證明本發(fā)明的方法分離度好，無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，且出峰時(shí)間短，檢測(cè)效率高。 W40] 試驗(yàn)例2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0041] 對(duì)實(shí)施例1標(biāo)樣母乳的高效液相色譜測(cè)定結(jié)果如表1所示，W左乙拉西坦和對(duì)乙 酷氨基酪的濃度比Y對(duì)左乙拉西坦和對(duì)乙酷氨基酪的峰面積比X線性回歸，得左乙拉西坦 的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y = 6. 856832X+0. 4314762巧=0. 9995, n = 2)，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖4。證 明按照本發(fā)明的方法，母乳中左乙拉西坦的檢出限可達(dá)1.0 ^邑/111以靈敏度高，且在1.0 ~ 40. 0 y g/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度好。表中LEV表示左乙拉西坦，Auv和A ISTD分 別表示左乙拉西坦和對(duì)乙酷氨基酪的峰面積，AuvAistd表示同一色譜圖中左乙拉西坦和對(duì) 乙酷氨基酪的峰面積比。
[0042] 表 1
[0043]
[0044] 試驗(yàn)例3精密度實(shí)驗(yàn)
[0045] 按照實(shí)施例1中步驟（2)的方法制備左乙拉西坦?jié)舛确謩e為1. 0,10. 0,40. 0 y g/ mL的標(biāo)樣母乳各5份，分別作為低、中、高立種濃度的標(biāo)樣母乳。按照實(shí)施例1中的方法，在 同一天內(nèi)和同一周內(nèi)分別對(duì)上述5份低、中、高=種濃度的標(biāo)樣母乳進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算其日 內(nèi)精密度值和日間精密度值。上述低、中、高=種濃度的標(biāo)樣母乳日內(nèi)RSD (n = 5)分別為 3. 51 %、3. 13%、5. 15%;日間 RSD (n = 5)分別為 4. 40%、6. 99%、6. 33%，說明本發(fā)明的方 法精密度好。
[0046] 試驗(yàn)例4回收率實(shí)驗(yàn)
[0047] 按照實(shí)施例1中步驟（2)的方法制備左乙拉西坦?jié)舛确謩e為1. 0,10. 0,40. 0 y g/ mL的標(biāo)樣母乳各5份，分別作為低、中、高S種濃度的標(biāo)樣母乳。按照實(shí)施例1中的方法，測(cè) 定濃度與實(shí)際配置濃度之比計(jì)算回收率。上述低、中、高=種濃度的標(biāo)樣母乳平均回收率分 別為 103. 20%、80. 61%、92. 58%，其 RSD(n = 5)分別為 5. 36%、2. 73%、3. 74%，平均回收 率均大于80%，說明本發(fā)明的方法準(zhǔn)確度好。
[0048] 試驗(yàn)例5抗干擾性實(shí)驗(yàn)
[0049] 左乙拉西坦臨床常與抗癒痛藥物拉莫=嗦、奧卡西平聯(lián)合使用，因此有必要進(jìn)行 左乙拉西坦的抗干擾性實(shí)驗(yàn)。分別取空白母乳180 iiL，置于I. 5血離屯、管中，分別加入 10 y g/mL的拉莫S嗦20 y L和10 y g/mL的奧卡西平20 y L作為供試母乳樣品。向上述母 乳中加入1血乙酸乙醋，旋滿混合20s，4000;r/min離屯、lOmin，吸取上層乙酸乙醋層850 Ji L 于1. 5mL離屯、管中，在50°C水浴下用氮?dú)獯蹈桑尤?00 y L流動(dòng)相后旋滿混合20s，按照實(shí) 施例1中步驟（3)的方法測(cè)定?？蒞看出，拉莫=嗦和奧卡西平在本發(fā)明方法的檢測(cè)條件 下無吸收，說明本發(fā)明方法在臨床上的抗干擾性強(qiáng)。
[0050] 綜上所述，本發(fā)明檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，精密度好，準(zhǔn)確性高， 穩(wěn)定性好，抗干擾性強(qiáng)，適用于臨床應(yīng)用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種母乳中左乙拉西坦的檢測(cè)方法，其特征在于：它是采用高效液相色譜法進(jìn)行檢 測(cè)，包括以下步驟： (1) 供試品制備：取供試母乳，加入供試母乳5倍體積的乙酸乙酯混勻，離心，取乙酸乙 酯層，吹干，復(fù)溶，作為供試品； (2) 檢測(cè)：取步驟（1)的供試品用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：固定相：C18色 譜柱；流動(dòng)相：甲醇-無機(jī)鹽溶液，二者的體積比為17:83,所述無機(jī)鹽溶液的pH為4. 5 ;檢 測(cè)波長(zhǎng)：210nm〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述檢測(cè)方法是定量檢測(cè)方法，步驟如 下： a、 供試品制備：取供試母乳，加入1/9倍體積的對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻，得內(nèi) 標(biāo)供試母乳，再加入內(nèi)標(biāo)供試母乳5倍體積的乙酸乙酯混勻，離心，取乙酸乙酯層，吹干，復(fù) 溶，作為供試品； b、 標(biāo)準(zhǔn)品制備：取空白母乳，加入1/8倍體積的左乙拉西坦標(biāo)準(zhǔn)品溶液和1/8倍體積的 對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻，得標(biāo)樣母乳，再加入標(biāo)樣母乳5倍體積的乙酸乙酯，混勻， 離心，取乙酸乙酯層，吹干，復(fù)溶，作為標(biāo)準(zhǔn)品； c、 檢測(cè)：取步驟a的供試品和步驟b的標(biāo)準(zhǔn)品，用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為： 固定相：C18色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-無機(jī)鹽溶液，二者的體積比為17:83,所述無機(jī)鹽的溶 液的pH為4. 5 ;檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm ; d、 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算供試母乳中左乙拉西坦的含量。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟a或步驟b中，對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品 溶液的濃度為10 μ g/mL。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟（1)、步驟a或步驟b中，離心的 轉(zhuǎn)速是4000r/min，離心的時(shí)間為lOmin。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟（1)、步驟a或步驟b中，吹干是 在50°C條件下用氮?dú)獯蹈伞?. 根據(jù)1或2所述的方法，其特征在于：步驟（1)、步驟a或步驟b中，復(fù)溶是采用步驟 (2)中的流動(dòng)相復(fù)溶。7. 根據(jù)1或2所述的方法，其特征在于：步驟（2)或步驟c中，所述C18色譜柱的規(guī)格 為150mmX4. 6mm，填料粒徑為5 μ m〇8. 根據(jù)1或2所述的方法，其特征在于：步驟（2)或步驟c中，所述流動(dòng)相中，無機(jī)鹽 溶液是濃度為〇. 〇lmol/L的磷酸二氫鉀溶液。9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟（2)或步驟c中，流動(dòng)相的流速 1. 0mL/min〇10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟（2)或步驟C中，檢測(cè)的柱溫 為 30°C。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105987961SQ201510058331
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月4日
【發(fā)明人】陳蕾, 周東, 謝貞建
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)華西醫(yī)院