一種利用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)甲殼類(lèi)精氨酸激酶的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)甲殼類(lèi)精氨酸激酶的方法，包括如下步驟：(1)提取蝦肌肉中的全蛋白并溶于pH為7～8的平衡緩沖液中，然后加入陰離子交換層析柱中，洗脫液洗脫，收集穿透峰所對(duì)應(yīng)的溶液即為樣品；(2)將所得樣品進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳，得電泳圖譜，將電泳圖譜中所得峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到樣品中甲殼類(lèi)精氨酸激酶的濃度。本發(fā)明用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)水產(chǎn)品過(guò)敏原——甲殼類(lèi)精氨酸激酶的方法，屬于過(guò)敏原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，提取蝦肌肉中的全蛋白，加入到陰離子交換層析柱中，用洗脫液洗脫，收集穿透峰對(duì)應(yīng)的溶液，加入毛細(xì)管電泳儀中，通過(guò)毛細(xì)管區(qū)帶電泳，對(duì)樣品液中的精氨酸激酶進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種利用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)甲殼類(lèi)精氨酸激酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及過(guò)敏原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)，是涉及一種甲殼類(lèi)精氨酸激酶的快 速定性及定量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量豐富，在人們營(yíng)養(yǎng)和健康中扮演重要角色，但對(duì)易感人群容易 引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。全世界大約有30%~40%的疾病由過(guò)敏引起，水產(chǎn)品過(guò)敏尤其嚴(yán)重， 有5%的兒童和2%的成年人會(huì)對(duì)某些水產(chǎn)品產(chǎn)生過(guò)敏。精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK) 廣泛存在于蝦、蟹等甲殼類(lèi)水產(chǎn)品中，是水產(chǎn)品中一種主要的過(guò)敏原。
[0003] 目前確定食品過(guò)敏原的檢測(cè)方法主要有以下幾種：
[0004] (1)利用抗原抗體特異性反應(yīng)的原理進(jìn)行檢測(cè)，通常采用酶聯(lián)免疫的方法，利用食 品過(guò)敏原抗體和過(guò)敏原進(jìn)行特異性的結(jié)合，然后酶標(biāo)記的二抗與過(guò)敏原形成復(fù)合物，利用 顯色底物，通過(guò)顏色的深淺來(lái)判斷食品中過(guò)敏原的含量；
[0005] (2)組胺釋放實(shí)驗(yàn)，組胺釋放實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)食品過(guò)敏原激發(fā)致敏的靶細(xì)胞，引起 細(xì)胞釋放組胺，組胺含量可應(yīng)用熒光測(cè)定法、放射免疫法等方法測(cè)定，與適宜參照進(jìn)行比 較，確定組胺釋放率陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，從而進(jìn)行過(guò)敏原活性測(cè)定及鑒定的一類(lèi)方法；
[0006] (3)過(guò)敏原指紋圖譜快速檢測(cè)方法，在食物總蛋白雙向電泳指紋圖譜的基礎(chǔ)上，對(duì) 總蛋白雙向電泳圖譜上的單個(gè)點(diǎn)進(jìn)行了飛行質(zhì)譜分析，以飛行質(zhì)譜圖譜的分子量峰和圖譜 形狀為基本參數(shù)來(lái)鑒定特征性的蛋白點(diǎn)。
[0007] 目前這些方法普遍存在檢測(cè)速度慢，操作復(fù)雜繁瑣，靈敏度、精確度不高的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)甲殼類(lèi)精氨酸激酶的方 法，簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、精確度高。
[0009] -種利用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)甲殼類(lèi)精氨酸激酶的方法，包括如下步驟：
[0010] (1)提取蝦肌肉中的全蛋白并溶于pH為7~8的平衡緩沖液中，然后加入陰離子交 換層析柱中，氯化鈉溶液作洗脫液進(jìn)行洗脫，收集穿透峰所對(duì)應(yīng)的溶液即為樣品；
[0011] (2)將所得樣品進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳，得電泳圖譜，將電泳圖譜中甲殼類(lèi)精氨酸激 酶所對(duì)應(yīng)的峰面積代入甲殼類(lèi)精氨酸激酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中計(jì)算得到樣品液中甲殼 類(lèi)精氨酸激酶的濃度。
[0012] 本發(fā)明用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)水產(chǎn)品過(guò)敏原一一甲殼類(lèi)精氨酸激酶，屬于過(guò)敏原 檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，提取蝦肌肉中的全蛋白，加入到陰離子交換層析柱中，用洗脫液洗脫，收集 穿透峰對(duì)應(yīng)的溶液，加入毛細(xì)管電泳儀中，通過(guò)毛細(xì)管區(qū)帶電泳，對(duì)樣品液中的精氨酸激酶 進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。本發(fā)明所采用的毛細(xì)管電泳法分析具有檢測(cè)速度快、靈敏度高的特 點(diǎn)，能快速、精確的定量檢測(cè)水產(chǎn)品中的精氨酸激酶，與以往檢測(cè)精氨酸激酶的方法相比具 有明顯優(yōu)勢(shì)。
[0013]本發(fā)明的步驟(1)中：
[0014]優(yōu)選地，蝦肌肉中的全蛋白采用試劑盒提取。
[0015] 所述試劑盒為凱基全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司）。
[0016] 優(yōu)選地，所述平衡緩沖液為pH為7.3~7.6的tris-HCl溶液，所述tris-HCl溶液的 濃度為5~10mm 〇l/L。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述平衡緩沖液為pH為7.5的tris-HCl溶液，所述 tris-HCl溶液的濃度為10mmol/L。
[0017] 優(yōu)選地，陰離子交換層析柱中所用填料為DEAE-Sepharose Fast Flow。
[0018] 優(yōu)選地，所述洗脫液為0-0.5mol/L的NaCl溶液，進(jìn)一步優(yōu)選為優(yōu)選0.3~0.4mol/L 的NaCl溶液。
[0019] 優(yōu)選地，溶有全蛋白的平衡緩沖液以0.3~0.6ml/min的流速加入陰離子交換層析 柱中，洗脫液以0.8~1.2ml/min的速度洗脫層析柱，進(jìn)一步優(yōu)選地，溶有全蛋白的平衡緩沖 液以〇.5ml/min的流速加入陰離子交換層析柱中，洗脫液以I .Oml/min的速度洗脫層析柱。
[0020] 進(jìn)行蛋白分離前以1.5ml/min的流速加入3~5倍柱體積的平衡緩沖液以平衡層析 柱。
[0021] 蝦為南美白對(duì)蝦。
[0022]本發(fā)明的步驟(2)中：
[0023]電泳條件為:毛細(xì)管選用未涂層石英毛細(xì)管柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為210~220nm，進(jìn)樣方式 為壓力進(jìn)樣，分離電壓為15±11^，毛細(xì)管柱溫為25±1°(：，運(yùn)行緩沖液為?!19.0~9.2的硼砂 緩沖溶液。
[0024] 優(yōu)選地，電泳條件為:毛細(xì)管選用未涂層石英毛細(xì)管柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，進(jìn)樣方 式為壓力進(jìn)樣(〇.5psi，5s)，分離電壓為15kv，毛細(xì)管柱溫為25°C，運(yùn)行緩沖液為pH9.2且濃 度為25mmol/L的硼砂緩沖溶液。
[0025] 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程的制作方法如下:精密配制甲殼類(lèi)精氨酸激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液5、 10、25、50、10(^8/!^按步驟(2)中電泳條件進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)3次，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線 性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程。
[0026] 毛細(xì)管的預(yù)處理:選用未涂層石英毛細(xì)管柱(45cmX75ym，P/ACE? MDQ System， Beckman公司），新毛細(xì)管柱先依次用甲醇沖洗10~12min，蒸餾水沖洗5~6min，0.1 M NaOH 溶液沖洗30~35min，蒸餾水沖洗5~6min，最后再用運(yùn)行緩沖液沖洗10~12min;進(jìn)樣前依 次用蒸餾水及運(yùn)行緩沖液各沖2~3min。
[0027] 進(jìn)一步地，新毛細(xì)管柱先依次用甲醇沖洗IOmin，蒸餾水沖洗5min，0.1 M NaOH溶液 沖洗30min，蒸餾水沖洗5min，最后再用運(yùn)行緩沖液沖洗IOmin;進(jìn)樣前依次用蒸餾水及運(yùn)行 緩沖液各沖2min。
[0028] 毛細(xì)管電泳在食品過(guò)敏原檢測(cè)方面的應(yīng)用并不廣泛，尤其在水產(chǎn)品過(guò)敏原的檢測(cè) 中，目前還沒(méi)有可行的方法。這是由于水產(chǎn)品中蛋白成分比較復(fù)雜，從而對(duì)水產(chǎn)品中某一過(guò) 敏原的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，而毛細(xì)管電泳檢測(cè)要求樣品中的成分盡可能的簡(jiǎn)單。因此，需要發(fā)展 簡(jiǎn)單、快速、有效的樣品前處理方法，使其適合毛細(xì)管電泳對(duì)樣品的要求。
[0029] 本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單、快速的樣品前處理方法。首先是利用試劑盒將水產(chǎn)品中 的全蛋白提取出來(lái)，再采用DEAE-Sepharose陰離子交換層析的方法將目的過(guò)敏原與其他蛋 白分離，使樣品成分單一，適合毛細(xì)管電泳對(duì)樣品的要求；同時(shí)，本發(fā)明對(duì)毛細(xì)管電泳的條 件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品中精氨酸激酶含量的測(cè)定。
[0030]在前處理的優(yōu)化條件與毛細(xì)管電泳優(yōu)化條件的組合下，檢測(cè)更快速、靈敏度和精 確度更高。
[0031 ]與現(xiàn)有的檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的有益效果如下：
[0032] 本發(fā)明所建立的方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)AK的定性和定量分析，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為快速、準(zhǔn) 確的檢測(cè)甲殼類(lèi)過(guò)敏原AK提供新的依據(jù)。本發(fā)明所采用的毛細(xì)管電泳法具有分析速度快， 分離度好，準(zhǔn)確度和靈敏度高的特點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 1.樣品的制備
[0035] 樣品的制備:使用試劑盒提取蝦肌肉中的全蛋白，將蝦全蛋白溶于PH7.5的平衡緩 沖液中得到樣品液。以1.5ml/min的流速加入3~5倍柱體積的平衡液，平衡層析柱，然后將 樣品液以0.5ml/min的流速加入陰離子交換層析柱中，然后用0.3~0.4mol/L的洗脫液以 1.0 ml/min的速度洗脫層析柱，收集穿透峰所對(duì)應(yīng)的溶液，即為樣品。
[0036] 2.毛細(xì)管電泳分析條件優(yōu)化
[0037] (1)毛細(xì)管選擇及預(yù)處理：選用未涂層石英毛細(xì)管柱（45cmX75ym，P/ACE? MDQ System，Beckman公司），新毛細(xì)管柱先依次用甲醇沖洗IOmin，蒸餾水沖洗5min，0.1 M NaOH 溶液沖洗30min，蒸餾水沖洗5min，最后再用運(yùn)行緩沖液沖洗IOmin;進(jìn)樣前依次用蒸餾水及 運(yùn)行緩沖液各沖2min;
[0038] (2)毛細(xì)管電泳分析條件:檢測(cè)波長(zhǎng)是214nm，進(jìn)樣方式為壓力進(jìn)樣(0.5psi，5s)， 分離電壓15kv，毛細(xì)管柱溫25°C，運(yùn)行緩沖液是25mmol/L硼砂緩沖溶液(pH9.2)。
[0039] 3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:精密配制AK標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、25、50、100yg/mL進(jìn)樣，每個(gè)樣品重 復(fù)3次，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果在5-100yg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方 程為Y = 0.0 73+0.029x，相關(guān)系數(shù)R2 = O. 998，在5-100yg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。 最低檢出濃度為0.1yg/mL(S/N>3)。
[0040] 4.回收率測(cè)定和精密度測(cè)定:樣品處理方法(不加底物），取5、10、25、50、100yg/mL 濃度進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度6個(gè)平行樣，計(jì)算回收率和精密度(見(jiàn)表1)。
[0041 ]表1精氨酸激酶添加回收率和精密度測(cè)定(η = 6)
L0043J 由表1的結(jié)果可知，在5-100yg/mL濃度添加范圍內(nèi)，回收率>95%，RSD〈6%，在蚩白 質(zhì)大分子的檢測(cè)中，是可以被接受的。
[0044] 實(shí)施例2
[0045] 1.樣品的制備
[0046] 樣品的制備:使用試劑盒提取蝦肌肉中的全蛋白，將蝦全蛋白溶于pH 7.5的平衡 緩沖液中得到樣品液。以1.5ml/min的流速加入3~5倍柱體積的平衡液，平衡層析柱，然后 將樣品液以〇 . 5ml/min的流速加入陰離子交換層析柱中，再用0.3~0.4mol/L的洗脫液以 1.0 ml/min的速度洗脫層析柱，收集穿透峰所對(duì)應(yīng)的溶液，即為樣品。
[0047] 2.毛細(xì)管電泳分析條件優(yōu)化
[0048] (1)毛細(xì)管選擇及預(yù)處理：選用未涂層石英毛細(xì)管柱（45cmX75ym，P/ACE? MDQ System，Beckman公司），新毛細(xì)管柱先依次用甲醇沖洗IOmin，蒸餾水沖洗5min，0.1 M NaOH 溶液沖洗30min，蒸餾水沖洗5min，最后再用運(yùn)行緩沖液沖洗IOmin;進(jìn)樣前依次用蒸餾水及 運(yùn)行緩沖液各沖2min;
[0049] (2)毛細(xì)管電泳分析條件:檢測(cè)波長(zhǎng)是214nm，進(jìn)樣方式為壓力進(jìn)樣(0.5psi，5s)， 分離電壓15kv，毛細(xì)管柱溫25°C，運(yùn)行緩沖液是30mmol/L硼砂緩沖溶液(pH9.2)。
[0050] 3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:精密配制AK標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、25、50、100yg/mL進(jìn)樣，每個(gè)樣品重 復(fù)3次，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果在5-100yg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方 程為￥ = 0.050+0.0281，相關(guān)系數(shù)妒=0.994，在5-10(^/1^濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。 最低檢出濃度為0.1yg/mL(S/N>3)。
[0051 ] 4.回收率測(cè)定和精密度測(cè)定:樣品處理方法(不加底物），取5、10、25、50、100yg/mL 濃度進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度6個(gè)平行樣，計(jì)算回收率和精密度(見(jiàn)表2)。
[0052]表2精氨酸激酶添加回收率和精密度測(cè)定(n = 6)
L〇〇54J 由表2的結(jié)果可知，在5-100yg/mL濃度添加范圍內(nèi)，回收率>95%，RSD〈6%，在蛍白 質(zhì)大分子的檢測(cè)中，是可以被接受的。
[0055]以上所述僅為本發(fā)明專(zhuān)利的具體實(shí)施案例，但本發(fā)明專(zhuān)利的技術(shù)特征并不局限于 此，任何相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的領(lǐng)域內(nèi)，所作的變化或修飾皆涵蓋在本發(fā)明的專(zhuān) 利范圍之中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)甲殼類(lèi)精氨酸激酶的方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 提取蝦肌肉中的全蛋白并溶于pH為7~8的平衡緩沖液中，然后加入陰離子交換層 析柱中，NaCl溶液洗脫，收集穿透峰所對(duì)應(yīng)的溶液即為樣品； (2) 將所得樣品進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳，得電泳圖譜，將電泳圖譜中甲殼類(lèi)精氨酸激酶所 對(duì)應(yīng)的峰面積代入甲殼類(lèi)精氨酸激酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中計(jì)算得到樣品液中甲殼類(lèi)精 氨酸激酶的濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(2)中電泳條件為:毛細(xì)管選用未涂層石 英毛細(xì)管柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為210~220nm，進(jìn)樣方式為壓力進(jìn)樣，分離電壓為15±lkv，毛細(xì)管柱 溫為25± 1°C，運(yùn)行緩沖液為pH9.0~9.2的硼砂緩沖溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(2)中電泳條件為:毛細(xì)管選用未涂層石 英毛細(xì)管柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，進(jìn)樣方式為壓力進(jìn)樣，壓力為0.5psi，進(jìn)樣時(shí)間為5s，分離 電壓為15kv，毛細(xì)管柱溫為25°C，運(yùn)行緩沖液為pH9.2且濃度為25mmol/L的硼砂緩沖溶液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程的制作方法如下：精 密配制甲殼類(lèi)精氨酸激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液5以8/1111^、1(^8/1]11^、25以8/1]11^、5(^8/1]11^、10(^8/1]11^，按步驟 (2)中電泳條件進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)3次，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回 歸方程。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述NaCl溶液的濃度為0-0.5mol/L。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述平衡緩沖液為pH為7.3~7.6的tris-HCl 溶液，所述tris-HCl溶液的濃度為5~10mm〇l/L。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述平衡緩沖液為pH為7.5的tris-HCl溶液， 所述tr i s -HC1溶液的濃度為1 Ommo 1 /L。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，蝦肌肉中的全蛋白采用試劑盒提取。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，陰離子交換層析柱中所用填料為DEAE-Sepharose Fast Flow〇10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，蝦為南美白對(duì)蝦。
【文檔編號(hào)】G01N27/447GK105938119SQ201610232038
【公開(kāi)日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年4月14日
【發(fā)明人】王彥波, 傅玲琳, 周瑾茹
【申請(qǐng)人】浙江工商大學(xué)