微分進(jìn)行預(yù)處理以增強(qiáng)形狀相關(guān)特 征之后的圖1的數(shù)據(jù)，
[0048] 圖3從具有特定的營養(yǎng)素缺乏的多個組織樣品以及健康對照植株記錄的熒光誘導(dǎo) 信號的中值時間序列。
[0049] 圖4通過在時間窗口 Α-Ε中的每一個中逐部分微分進(jìn)行預(yù)處理以增強(qiáng)形狀相關(guān)特 征之后的圖3的數(shù)據(jù)，
[0050] 圖5針對獨(dú)立測量磷濃度(ppm)的磷濃度(ppm)的PLS預(yù)測，
[00511圖6基于I相周圍的MSC預(yù)處理數(shù)據(jù)的PCA模型的前兩種主成分PC1和PC2的PCA得分 圖。
[0052]詳細(xì)說明/實(shí)例 [0053] 熒光誘導(dǎo)瞬變的記錄
[0054]在所有實(shí)例中，使用商業(yè)上可獲得的漢莎科學(xué)儀器"Handy PEA"進(jìn)行葉綠素a熒光 瞬變測量。使用配合這種儀器的暗適應(yīng)夾具，將有待分析的組織樣品初始暗適應(yīng)至少20分 鐘，從而有效地停止所有光合作用活動并且最大化0JIP-上升的強(qiáng)度增大。在測量時，將 Handy PEA的傳感器單元放置在暗適應(yīng)夾具上，從而允許組織樣品暴露于傳感器和二極管 而不讓光進(jìn)入。最初，通過使用非光化性光的短閃光并測量來自組織樣品的響應(yīng)來確定背 景水平，并且相應(yīng)地調(diào)節(jié)檢測器的增益。
[0055]在這種初始調(diào)節(jié)之后，通過使用被光過濾至650nm的最大波長的三盞紅色LED照射 暴露葉片來進(jìn)行實(shí)際測量。在測量的持續(xù)期間使這種光持續(xù)亮著，并且以至少3000μπιο1 πΓ 2S4的光子通量輻照組織樣品以便在測量過程中用光化性光使組織樣品有效飽和。
[0056] 接通光化性光誘導(dǎo)一個葉綠素a熒光誘導(dǎo)信號，該信號具有熒光強(qiáng)度的一個快速 上升，之后是一個緩慢下降。熒光信號在光化性光的波長以上的波長處出現(xiàn)。使用一個PIN 光電二極管作為檢測器來記錄熒光瞬變的強(qiáng)度。光過濾用于確保僅記錄較長波長(>650nm) 的熒光信號，從而避免源于到達(dá)該檢測器的光化性光的假象。該P(yáng)IN檢測器對在到達(dá)該檢測 器的全光譜范圍上的所誘導(dǎo)的熒光信號的強(qiáng)度進(jìn)行積分。
[0057] 以作為演化的總時間的函數(shù)的在連續(xù)測量之間的增加的間隔記錄熒光強(qiáng)度測量 的時間序列，其中總時間軸的原點(diǎn)被定義為光化性光接通時的點(diǎn)。以下給出在接通光化性 光之后在演化的總時間的不同時間窗口中針對一組信號數(shù)據(jù)記錄的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)量，以及連續(xù) 數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的間隔的概述。時間間隔的選擇分布是時間間隔隨總時間演化而在一定程度上 對數(shù)增加的一個例子。然而，其他分布可容易地被技術(shù)人員想到以便相對于作為演化的總 時間的函數(shù)的熒光強(qiáng)度的進(jìn)展的總體對數(shù)性質(zhì)調(diào)整所記錄的信號數(shù)據(jù)的時間分辨率。
[0059] 出于本發(fā)明實(shí)例的目的，因此各熒光誘導(dǎo)數(shù)據(jù)集由145個單獨(dú)測量組成，并且提供 使用對數(shù)時標(biāo)最佳可視化的一個時間依賴性熒光曲線。這些數(shù)據(jù)集涵蓋前10秒的熒光誘導(dǎo) 瞬變，包括快速熒光上升、峰值強(qiáng)度、以及緩慢下降的起點(diǎn)。當(dāng)僅僅研究最高至且包括強(qiáng)度 峰的熒光上升時，僅記錄大約前3秒，其中僅記錄第一秒可能就足夠了。
[0060] 參考營養(yǎng)狀態(tài)
[0061] 進(jìn)行兩個實(shí)驗，這兩個實(shí)驗提供兩組參考營養(yǎng)狀態(tài)，各自涵蓋具有不同水平的磷 缺乏的春大麥(Quench品種）的一系列生理狀態(tài)。在兩種情況下，大麥植株水培生長，從而允 許清楚控制每個植株可獲得的營養(yǎng)素水平。將植株分成在兩個實(shí)驗之間略有不同的四個不 同的處理，但是在兩種情況下，它們均由一個對照處理(P0)、以及具有減小的P濃度的三個P 處理(P1-P3)組成。
[0062] 在兩個實(shí)驗中，在具有18/15°C的最低日/夜溫度和每天16小時光照(最低250-300 μπιο?光子nf2s4)的溫室中，將春大麥(Quench品種)在浸泡的Sorbix輕石中發(fā)芽八天，并且 隨后在4L不透明培養(yǎng)單元中水培生長。這些生長單元中的營養(yǎng)液是基于具有以下各項的標(biāo) 準(zhǔn)對照處理：200μΜ ΚΗ2Ρ〇4、200μΜ K2S〇4、300yM MgS〇4.7H20、100yM NaCl、300yM Mg (Ν03)2·6Η20、900μΜ Ca(N〇3)2.4H20、600yM ΚΝ03、50μΜ Fe(III)-EDTA-Na、0.8yM Na2Mo〇4 · 2Η20、1μΜ MnCl2 · 4Η20、0·7μΜ ZnCh、0.8yM CuS〇4 · 5Η20、2μΜ H3BO3。然而，為了 避免EDTA中毒，在轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)單元后的第一生長周中將微量營養(yǎng)素的濃度減半。
[0063]向每個培養(yǎng)單元中連續(xù)充入過濾后的空氣并且每周更換營養(yǎng)液以確保所有必需 營養(yǎng)素的最佳營養(yǎng)素利用度，其中誘導(dǎo)磷缺乏的植物的磷除外。使用超純HC1將pH保持恒定 在 6·0±0·3 下。
[0064]在整個實(shí)驗過程中，對照處理具有足量的所有營養(yǎng)素，并且向Ρ1、Ρ2、以及Ρ3處理 供應(yīng)減小量的Ρ。在兩個實(shí)驗中，Ρ1水平的意圖在于估計Ρ水平，使得Ρ1恰好滿足植物的Ρ需 求，同時避免在對照植株中存在過度攝取?；谙惹敖?jīng)驗，Ρ1單元中的磷濃度被設(shè)定為89μΜ (即，89μΜ ΚΗ2Ρ〇4)。兩個實(shí)驗中的Ρ2水平被設(shè)定為Ρ1水平的50%，并且實(shí)驗1和2中的Ρ3水平 分別被設(shè)定為Ρ1水平的10%和25 %。特別地，對于實(shí)驗2，在減小ΚΗ2Ρ〇4濃度時去除的鉀替換 成添加另外的KC1-從而在整個實(shí)驗中在所有四個處理中保持恒定的鉀含量。
[0065] 實(shí)驗1-氣候室
[0066]將發(fā)芽植株轉(zhuǎn)移到32個培養(yǎng)單元中，每個單元含有10個植株，并且將它們分成兩 組(Α和Β)，每組具有16個單元(第1天）。在整個實(shí)驗過程中，將Α組在正常光線設(shè)置(400μπι〇1 光子nr 2。)和20°C的恒溫下的氣候室中培養(yǎng)。將Β組在具有與Α相同的初始設(shè)置的氣候室中 培養(yǎng)，然而，當(dāng)誘導(dǎo)降低的P水平時，將設(shè)置變成高光強(qiáng)度(750μπι 〇1光子πι?)和15°C的恒 溫。每周兩次將單元的位置在每個室內(nèi)隨機(jī)改變。
[0067] 將每個氣候室中的16個單元分成四個不同的P處理(對照、Ρ1、P2、以及P3)。對于前 10天，向PI、P2、以及P3單元均供應(yīng)營養(yǎng)液P1，以避免在預(yù)先培養(yǎng)階段中過度攝取P，但允許 產(chǎn)生健康的生物質(zhì)。10天后，對上述三種限制P水平進(jìn)行誘導(dǎo)。在第21天，用一種不含磷的營 養(yǎng)液替換全部三種限制P的處理。
[0068]在實(shí)驗期間在每個氣候室中對植物采樣兩次。在第21天進(jìn)行第一次采樣并且在第 28天進(jìn)行最后一次采樣，此時P1-3植株已有七天完全得不到磷。每次采樣時，使用Handy PEA分析來自每個培養(yǎng)單元中的五個不同植株(隨后被收獲）的最嫩完全展開葉，并且隨后 將來自每個獨(dú)立培養(yǎng)單元的葉片匯集在一起作為一個樣本并使用感應(yīng)耦合等離子體發(fā)射 光譜法（ICP-0ES)進(jìn)行分析。這樣，獲得來自每個培養(yǎng)單元的最嫩完全成熟葉的平均磷含 量，并且使用此平均磷含量作為該培養(yǎng)單元中的個體植株的五個葉綠素a熒光測量中的每 一個的參考值。
[0069] 實(shí)驗2-溫室
[0070] 將發(fā)芽植株轉(zhuǎn)移到16個培養(yǎng)單元中，每個培養(yǎng)單元含有四個植株(第一天），并且 在與發(fā)芽期相同的溫室條件下培養(yǎng)。將16個培養(yǎng)單元分成四個不同的磷處理(對照、P1、P2、 以及P3)，并且每周兩次隨機(jī)改變它們的位置。
[0071] 在前十天的過程中，所有四個不同的處理均被給予控制水平的營養(yǎng)素供應(yīng)。在第 10天，使用各自的營養(yǎng)液誘導(dǎo)P1、P2和P3水平。在第21天，將磷從P1-3處理中完全移除。在第 28天，向全部培養(yǎng)單元供應(yīng)控制水平的營養(yǎng)素濃度以觀察磷再供給的潛在影響。
[0072] 在實(shí)驗期間，在第21天、第23天、第28天以及第30天對植株進(jìn)行四次采樣。收獲來 自每個培養(yǎng)單元的一個植株，并且在最嫩完全展開葉和第二嫩完全展開葉二者上進(jìn)行葉綠 素 a測量。不同于實(shí)驗1，隨后使用ICP-0ES單獨(dú)分析每個葉片，從而給出每個葉綠素a熒光測 量的特定參考值。
[0073] 數(shù)據(jù)處理
[0074] 本發(fā)明的核心優(yōu)點(diǎn)之一在于洞悉熒光誘導(dǎo)瞬變進(jìn)展且尤其是上升部分中的形狀 相關(guān)特征的適當(dāng)分析產(chǎn)生關(guān)于相對于特定營養(yǎng)素而言的缺乏狀態(tài)的營養(yǎng)素特異性信息。為 此，檢測并分析相對于特定營養(yǎng)素而言與無脅迫狀態(tài)相比形狀相關(guān)特征的改變。根據(jù)本發(fā) 明，通過構(gòu)建一個經(jīng)驗?zāi)Ｐ筒⑶覍⑦@個經(jīng)驗?zāi)Ｐ蛻?yīng)用到從待測植物獲得的信號數(shù)據(jù)上來由 這些改變確定營養(yǎng)狀態(tài)，該經(jīng)驗?zāi)Ｐ驮趨⒖紨?shù)據(jù)的基礎(chǔ)上將特定參考營養(yǎng)狀態(tài)與熒光誘導(dǎo) 瞬變中的形狀相關(guān)特征相關(guān)聯(lián)。參考數(shù)據(jù)是從參考植物（即，被制備成相對于如上所述的特 定營養(yǎng)素處于特定營養(yǎng)狀態(tài)的植物)獲得的預(yù)先記錄的熒光誘導(dǎo)時間序列。信號數(shù)據(jù)是從 待測植物獲得的熒光誘導(dǎo)時間序列。使用多變量分析技術(shù)構(gòu)建經(jīng)驗?zāi)Ｐ汀?br>[0075] 預(yù)處理
[0076] 將預(yù)處理應(yīng)用到熒光誘導(dǎo)數(shù)據(jù)以便增強(qiáng)形狀相關(guān)特征。為了一個給定分析，使用 相同的預(yù)處理技術(shù)對用于構(gòu)建經(jīng)驗?zāi)Ｐ偷男盘枖?shù)據(jù)和相應(yīng)的參考數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理?？刹捎?許多不同的預(yù)處理技術(shù)。在此呈現(xiàn)這些預(yù)處理技術(shù)中的兩種。在一個分析中，將與通常用于 紅外光譜的多重散射校正相同的算法應(yīng)用到選自I相周圍的時間范圍（在2.6 m s與10 0 m s之 間）的時間依賴性熒光誘導(dǎo)數(shù)據(jù)的一個子集上。對于增強(qiáng)熒光誘導(dǎo)數(shù)據(jù)的進(jìn)展中的形狀相 關(guān)特征的目的，多重散射校正算法作為預(yù)處理的效果出人意料得好。在另一個分析中，通過 取得兩個后續(xù)數(shù)據(jù)點(diǎn)的熒光信號的差異來應(yīng)用數(shù)值微分。對于上述時間窗口 A-F中的每一 個，逐部分進(jìn)行微分。
[0077] 圖1和圖2示出通過特定營養(yǎng)素(此處為磷）的不同生物活性濃度的微分造成的形 狀相關(guān)特征的增強(qiáng)。圖1示出具有對數(shù)/線性標(biāo)度上的不同磷濃度的四個組織樣品的作為時 間函數(shù)的所記錄的熒光誘導(dǎo)信號。該數(shù)據(jù)涵蓋在Os-lOs之間的時間間隔中的0JIP上升和隨 后下降的起點(diǎn)。圖2示出通過應(yīng)用到時間窗口 A-F中的每一個中的熒光誘導(dǎo)信號上的逐部分 微分