實時檢測活體藻細胞油脂含量的熒光分光光度法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微藻株油脂含量的快速篩選方法，特別是一種實時檢測活體藻細胞油脂含量的熒光分光光度法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，在傳統(tǒng)的藻細胞油脂含量檢測方法中，最經(jīng)典的實驗方法是通過物理方法提取藻油脂并稱重計算，但是這一過程太繁瑣，容易引起實驗誤差，以及測量精度不準的缺點。
[0003]I)以Bligh EG和Dyer WJ為代表的利用油脂干重稱量法測定微藻細胞油脂含量的測定是最經(jīng)典的藻細胞油脂測定方法。微藻油脂含量測定法最初是利用有機溶劑提取法對藻細胞進行破壁及油脂的提取，該法在良好的操作條件下可以獲得較精準的數(shù)據(jù)，但是過程耗時較長，而且還需對藻細胞原料進行準確的稱量，提取劑的選擇和溶劑的去除程度也直接影響數(shù)據(jù)的可靠性。
[0004]2)Nile red熒光分光光度法被應用于藻細胞油脂含量的測定的報道，但是由于Nile red試劑的水不溶性，以及環(huán)境的pH和溶液離子強度對Nile red對滲入藻細胞的程度是不一樣的，所以應用這種方法必須有一套檢測的實驗標準參數(shù)，而目前統(tǒng)一的針對某種微藻的Nile red熒光分光光度法的實驗研究方法的應用還沒被詳細報道過。
[0005]上述兩種方法具有不同的缺點，導致不能快速實時，高通量的測定活細胞油脂含量:
[0006](I)利用傳統(tǒng)干重稱量法測定油脂含量由于其操作繁瑣，如藻粉的制備、油脂的提取、油脂的干燥等過程需要至少一周才能完成，對于快速測定的要求是沒法滿足的。
[0007](2)現(xiàn)有的Nile red熒光分光光度法只是定性的實驗，沒有針對某種微藻實驗操作的標準流程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是要提供一種實時檢測活體藻細胞油脂含量的熒光分光光度法，實現(xiàn)高通量快速篩選高油脂含量微藻株。
[0009]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:藻細胞油脂含量的焚光分光光度法:不同種屬和不同形態(tài)的微藻其結(jié)構(gòu)和形狀存在的差異，針對所述的微藻進行實驗、測定，不同種屬和不同形態(tài)的微藻所需的染色條件有所不同，包括有藻細胞溶液濃度的選擇，熒光染色劑劑量的選定，染色過程的環(huán)境的選定以及熒光強度測定條件的參數(shù)選擇;藻細胞濃度:I X 1Vml-8X 106/ml;藻液體積:5ml ；Nile red在水相的溶度:0.5-4yg/ml;漩渦震蕩時間:0.5_4min;
[0010]具體步驟如下:
[0011](I)、小球藻油脂含量的測定方法:制備含幾組相同濃度的懸浮藻細胞，將Nilered用有機溶劑溶解成0.lmg/ml后按相同劑量加入到藻懸液中；所述的有機溶劑必須經(jīng)過檢測具有水溶性和細胞滲透性;所述的有機溶劑為二甲亞砜；
[0012](2)、控制染色過程的混合懸液震蕩的時間參數(shù)為0.5-4min，溶液pH: 6_8參數(shù)，確定最佳染色操作過程，操作參數(shù)通過熒光顯微鏡觀察來確定；
[0013]在熒光顯微鏡下的A組和B組，在兩種條件下的細胞形態(tài)和顏色確定染色過程的完成;A組:染色完全的藻細胞，在熒光條件下呈綠色;B組:未染色的藻細胞，在熒光條件下呈紅色；
[0014](3)、實驗確定發(fā)射波，通過熒光掃描確定合適的發(fā)射光波長，不同的藻細胞實驗發(fā)射波的波長范圍為藍光激發(fā)光源下420-490nm;
[0015](4)、針對不同種屬的微藻優(yōu)化不同的實驗操作參數(shù)，制定標準的測定方法。
[0016]有益效果及優(yōu)點:由于采用了上述方案，實時快速篩選高油脂含量微藻的優(yōu)良藻株，利用一種焚光染色劑NiIe red對藻類活細胞的油脂含量進行實時監(jiān)測分析。NiIe red滲透進藻細胞中與油脂成分進行結(jié)合并生成熒光物質(zhì)，在優(yōu)化的實驗條件下通過檢測藻細胞的熒光強度數(shù)值，推算出藻細胞的油脂含量。
[0017]實時檢測活體藻細胞油脂含量的熒光分光光度法可以根據(jù)油脂和熒光強度同比例增長的效果，通過簡單的配置一定濃度細胞染色和進行染色處理及熒光強度測定的步驟，精確測定活藻細胞的油脂含量。該方法免去了傳統(tǒng)干重法油脂測定法中必須制定干燥的藻粉及油脂的提取等繁瑣的步驟，直接利用活細胞的藻液實時快速精確測定油脂含量，實現(xiàn)了高通量快速篩選出高油脂含量的微藻株。
【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明在熒光條件下呈綠色的染色完全的藻細胞圖。
[0019]圖2是本發(fā)明在熒光條件下呈紅色的未染色的藻細胞圖。
[0020]圖3為在藍光激發(fā)下Nilered染色藻細胞(I)、為染色藻細胞(2)及Nile red染色劑的發(fā)射光譜圖。
【具體實施方式】
[0021 ]實施例1:藻細胞油脂含量的焚光分光光度法:不同種屬和不同形態(tài)的微藻其結(jié)構(gòu)和形狀存在的差異，針對所述的微藻進行實驗、測定，不同種屬和不同形態(tài)的微藻所需的染色條件有所不同，包括有藻細胞溶液濃度的選擇，熒光染色劑劑量的選定，染色過程的環(huán)境的選定以及熒光強度測定條件的參數(shù)選擇;藻細胞濃度:I X 1iVml-S X 106/ml;藻液體積:5ml; Ni Ie red在水相的溶度:0.5-4yg/ml;漩渦震蕩時間:0.5_4min;
[0022]具體步驟如下:
[0023](I)、小球藻油脂含量的測定方法:制備含幾組相同濃度的懸浮藻細胞，因為Nilered的水溶性差，用有機溶劑配制成母液后再加入藻液中；將Nile red用有機溶劑溶解成0.lmg/ml后按相同劑量加入到藻懸液中；所述的有機溶劑必須經(jīng)過檢測具有水溶性和細胞滲透性;所述的有機溶劑為二甲亞砜；
[0024](2)、控制染色過程的混合懸液震蕩的時間參數(shù)為0.5-4min，溶液pH: 6_8參數(shù)，確定最佳染色操作過程，操作參數(shù)通過熒光顯微鏡觀察來確定；
[0025]在熒光顯微鏡下的A組和B組，在兩種條件下的細胞形態(tài)和顏色確定染色過程的完成;A組:染色完全的藻細胞，在熒光條件下呈綠色;B組:未染色的藻細胞，在熒光條件下呈紅色；
[0026](3)、實驗確定發(fā)射波，通過熒光掃描確定合適的發(fā)射光波長，不同的藻細胞實驗發(fā)射波的波長范圍為藍光激發(fā)光源下420-490nm;
[0027](4)、針對不同種屬的微藻優(yōu)化不同的實驗操作參數(shù)，制定標準的測定方法。
【主權(quán)項】
1.一種實時檢測活體藻細胞油脂含量的熒光分光光度法，其特征是:藻細胞油脂含量的焚光分光光度法:不同種屬和不同形態(tài)的微藻其結(jié)構(gòu)和形狀存在的差異，針對所述的微藻進行實驗、測定，不同種屬和不同形態(tài)的微藻所需的染色條件有所不同，包括有藻細胞溶液濃度的選擇，熒光染色劑劑量的選定，染色過程的環(huán)境的選定以及熒光強度測定條件的參數(shù)選擇;藻細胞濃度:1 X 106/ml-8 X 106/ml;藻液體積:5ml ;Ni Ie red在水相的溶度:0.5-4yg/ml;漩渦震蕩時間:0.5-4min; 具體步驟如下: (1)、小球藻油脂含量的測定方法:制備含幾組相同濃度的懸浮藻細胞，將Nilered用有機溶劑溶解成0.lmg/ml后按相同劑量加入到藻懸液中；所述的有機溶劑必須經(jīng)過檢測具有水溶性和細胞滲透性;所述的有機溶劑為二甲亞砜； (2)、控制染色過程的混合懸液震蕩的時間參數(shù)為0.5-4min，溶液pH: 6_8參數(shù)，確定最佳染色操作過程，操作參數(shù)通過熒光顯微鏡觀察來確定； 在熒光顯微鏡下的A組和B組，在兩種條件下的細胞形態(tài)和顏色確定染色過程的完成;A組:染色完全的藻細胞，在熒光條件下呈綠色;B組:未染色的藻細胞，在熒光條件下呈紅色； (3)、實驗確定發(fā)射波，通過焚光掃描確定合適的發(fā)射光波長，不同的藻細胞實驗發(fā)射波的波長范圍為藍光激發(fā)光源下420-490nm; (4 )、針對不同種屬的微藻優(yōu)化不同的實驗操作參數(shù)，制定標準的測定方法。
【專利摘要】一種實時檢測活體藻細胞油脂含量的熒光分光光度法，屬于微藻株油脂含量的快速篩選方法。藻細胞油脂含量的熒光分光光度法：不同種屬和不同形態(tài)的微藻其結(jié)構(gòu)和形狀存在的差異，針對所述的微藻進行實驗、測定，不同種屬和不同形態(tài)的微藻所需的染色條件有所不同，包括有藻細胞溶液濃度的選擇，熒光染色劑劑量的選定，染色過程的環(huán)境的選定以及熒光強度測定條件的參數(shù)選擇；藻細胞濃度：1×106/ml-8×106/ml；藻液體積：5ml；Nile？red在水相的溶度：0.5-4μg/ml；漩渦震蕩時間：0.5-4min。優(yōu)點：該方法免去了傳統(tǒng)干重法油脂測定法中必須制定干燥的藻粉及油脂的提取等繁瑣的步驟，直接利用活細胞的藻液實時快速精確測定油脂含量，實現(xiàn)了高通量快速篩選出高油脂含量的微藻株。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN105548116
【申請?zhí)枴緾N201610003660
【發(fā)明人】黃冠華, 何環(huán), 匡亞莉
【申請人】中國礦業(yè)大學
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月4日