一種快速檢測海洋雙殼類生物體內(nèi)類胡蘿卜素含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于類胡蘿卜素含量檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測海洋雙殼類生 物體內(nèi)類胡蘿卜素含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 類胡蘿卜素(Carotenoids，CAR)作為一種多烯類物質(zhì)因其含有多不飽和雙鍵而具 有一定的抗氧化能力，同時還具有其他多種生物學(xué)功能。有研究表明貝類體內(nèi)的類胡蘿卜素 含量與貝類的生長生活以及性腺發(fā)育均表現(xiàn)出一定的關(guān)聯(lián)性。如對蝦夷扇貝 (Patinopecten yessoensis)的研究表明在性腺發(fā)育時期閉殼肌類胡蘿卜素的含量達(dá)到最 高值，生殖期過后類胡蘿卜素的含量隨之降低；同時富含類胡蘿卜素的個體在苗期、分籠養(yǎng)殖 過程及產(chǎn)卵后的成活率均高于對照組，具有顯著較高的抗逆性；而對華貴櫛孔扇貝 (Chlamys nobilis Reeve)的研究則發(fā)現(xiàn)富含類胡蘿卜素的個體具有較高的總抗氧化能力， 以及類胡蘿卜素含量與該物種性別、殼色和組織間存在顯著相關(guān)性。此外還有研究發(fā)現(xiàn)三角 帆蟲豐(Hyriopsis cumingii)體內(nèi)的類胡蘿卜素含量與其珍珠層的色澤之間存在一定的關(guān) 聯(lián)，因此類胡蘿卜素含量同樣也關(guān)乎珍珠貝的育珠質(zhì)量。綜上，鑒于類胡蘿卜素對雙殼類生物 多種生長及生理活動的影響，深入探討CAR在雙殼類生物群體內(nèi)的含量水平和分布狀況是 非常必要的。
[0003] 類胡蘿卜素作為一種廣受關(guān)注的天然色素廣泛存在于各類軟體動物中，如各類扇 貝、珍珠貝、烏賊、螺等，其組織分布包括軟體部及殼等部位。然而，迄今為止，對這些物種體 內(nèi)的CAR含量的大批量、群體水平的快速檢測方法鮮有研究?，F(xiàn)有的測定方法是采用干燥、 提取和分光光度檢測的流程和方法來進行的，而這種常規(guī)的方法卻存在著若干缺點，比如： 1、耗時長。樣品的冷凍干燥處理一般需要2~3天才能完成且每次處理的樣品數(shù)量有限，樣 品的研磨、稱量、提取和檢測同樣費工費時，工作強度較大;2、用樣量多。出于保證精確度的 考慮，每次需要用的干燥樣品量為0.1~〇.2g，較大地消耗了實驗樣品；3、涉及揮發(fā)性藥品。 樣品在提取過程中需要用到丙酮，該藥品在室溫下易揮發(fā)，且屬于易燃物品，故對實驗室環(huán) 境及安全存在一定影響;4、實用性弱。每次只能夠測定少量樣品，不能夠批量測定，實用性 弱。這種常規(guī)測定總類胡蘿卜素含量(Total carotenoids contents，TCC)的方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不 能適用于大批量、多批次的雙殼貝類科學(xué)研究的需要，因此，必須建立一種快速、高效并且 可靠的測定TCC的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速檢測海洋雙殼類生物體內(nèi)類胡蘿卜素 含量的方法，該方法重復(fù)性好、實用性強、快速高效，并且除了建立回歸曲線需要少量樣品 之外不再消耗樣品。
[0005] 本發(fā)明方法通過使用色差儀對部分海洋雙殼類生物體閉殼肌組織切片進行色差 檢測，獲取相對紅度參數(shù)（A a)，然后將其與TCC相關(guān)聯(lián)并建立△ a-TCC的線性回歸方程，從 而實現(xiàn)由相關(guān)的色差參數(shù)對個體類胡蘿卜素含量的評估。
[0006] 由于色差指標(biāo)在檢測過程中可直接施用新鮮組織樣品，無需對樣品進行干燥、研 磨和萃取等操作，因此具有快速、高效的優(yōu)勢，尤其是面對大量待測樣品時次優(yōu)勢尤為明 顯，實用性極強。并且，在后續(xù)檢測過程中基本沒有樣品消耗，檢測后的樣品可繼續(xù)用于其 他多種生理生化指標(biāo)的檢測，因此極大提高了單個樣品的利用率。此外，檢測過程中避免了 傳統(tǒng)的TCC檢測所需要的有機溶劑和多種大型設(shè)備，因此又具有安全、簡便的特點。
[0007] 本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種快速檢測海 洋雙殼類生物體內(nèi)類胡蘿卜素含量的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)組織取樣和預(yù)處理:選取海洋雙殼類生物體閉殼肌樣品若干，取樣并充分冷凍 后橫向切片處理，獲得組織切片；
[0009] (2)組織切片色差檢測:將組織切片采用色差儀進行檢測，色差檢測結(jié)果即相對紅 度A a;
[0010] (3)總類胡蘿卜素含量TCC檢測:采用傳統(tǒng)方法檢測步驟(2)中進行過色差檢測的組 織切片的總類胡蘿卜素含量TCC;
[0011] (4)建立相對紅度Δ a-TCC回歸曲線:將步驟(2)中檢測的組織切片的相對紅度Δ a 與步驟(3)中檢測的組織切片的總類胡蘿卜素含量TCC建立線性回歸方程；
[0012] (5)待測海洋雙殼類生物體閉殼肌樣品的總類胡蘿卜素含量TCC檢測：取待測海洋 雙殼類生物體閉殼肌樣品，測試其相對紅度A a，代入步驟(4)中建立的線性回歸方程，即可 獲得該待測海洋雙殼類生物體閉殼肌樣品的總類胡蘿卜素含量TCC。
[0013] 在上述快速檢測海洋雙殼類生物體內(nèi)類胡蘿卜素含量的方法中：
[0014] 步驟(1)中所述的海洋雙殼類生物體優(yōu)選為華貴櫛孔扇貝或合浦珠母貝。
[0015] 步驟（1)中獲取的組織切片的厚度優(yōu)選為2~3mm，但以保證同批次樣品切片厚度 均一為宜。
[0016] 步驟(1)中海洋雙殼類生物體閉殼肌樣品的數(shù)量為15個以上。更佳為30個以上。
[0017] 步驟(2)中將組織切片采用色差儀進行檢測時，將組織切片置于與其大小相適配 的樣品槽中，同時在樣品上覆蓋一邊緣進行過遮光處理的蓋玻片，將蓋玻片壓緊樣品以確 保樣品的厚度與樣品槽的厚度相同，保證樣品檢測面平滑且檢測厚度一致，減小誤差，檢測 時將色差儀檢測口緊貼于蓋玻片上，避免漏光。
[0018] 步驟(4)中優(yōu)選采用SPSS軟件將步驟(2)中檢測的組織切片的相對紅度△ a與步驟 (3)中檢測的組織切片的總類胡蘿卜素含量TCC建立線性回歸方程。
[0019] 本發(fā)明步驟(2)中采用傳統(tǒng)方法檢測若干海洋雙殼類生物體閉殼肌樣品的總類胡 蘿卜素含量TCC的優(yōu)選方式如下：
[0020] (1)選取色差檢測后的樣品，置于冷凍干燥機中進行充分的冷凍干燥；
[0021] (2)將干燥后的樣品在研缽中充分研磨，然后稱取0.1~0.2g于10mL離心管中，記 錄樣品精確重量W，每個樣品取兩份；
[0022] (3)往(2)中的離心管加入丙酮(分析純）2mL，密封后充分震蕩，于避光靜置8h或過 夜；
[0023] (4)以5000r/min對離心管進行離心，lOmin，轉(zhuǎn)移上清液于新的離心管里，并往下 層沉淀中再次加入丙酮2mL，充分震蕩，避光靜置4h后以上述條件再次離心，取上清液并與 第一次離心之上清液合并；
[0024] (5)使用紫外-可見光分光光度計對(4)中最后所得之上清液進行480nm處的吸光 值進行檢測，記錄各樣品對應(yīng)之OD480 ;
[0025] (6)TCC按照公式TCC(yg/g)=OD48〇 · VX104/(E(1%lcm)XW)計算，公式中OD480為 480nm處吸光值，V為提取液體積(mL)，W為樣品重(g)，Ε(ι%ι?)為在1 cm光程長的比色杯中1 g/ L濃度溶質(zhì)的理論吸收值，Εα%ι?) = 1900。
[0026] 本發(fā)明利用色差儀作為主要檢測設(shè)備，并輔以分光光度計測定樣品的總類胡蘿卜 素含量，只需用常規(guī)方法對少量樣品進行檢測并建立起色差-TCC回歸方程，其后大量的待 測樣品則無需干燥、研磨和提取等步驟，只需經(jīng)過簡單切片處理即可用于檢測，因而能夠在 極短的時間內(nèi)，對樣品進行快速、準(zhǔn)確的批量測定，檢測過程中樣品無消耗并且檢測后的樣 品還可繼續(xù)進行其他多種指標(biāo)的檢測，從而為雙殼貝類類胡蘿卜素含量進行大批量的檢測 提供一個簡便快速的方法。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0028] (1)需時短，操作簡單，在建立起回歸方程后，每個樣品僅需數(shù)秒鐘，極大縮短檢測 時間和流程；
[0029] (2)用樣量少，每次需要用的樣品少，只需少量的組織切片；
[0030] (3)重復(fù)性好，樣品重復(fù)測量值間的變化較小、重復(fù)性好；
[0031] (4)實用性強，能夠批量地檢測大量樣品，對待檢樣品的保存無嚴(yán)苛要求，并且檢 測過程中樣品無消耗、無脫水以及無變質(zhì)，檢測完成后可繼續(xù)用于多種理化指標(biāo)的檢測；
[0032] (5)本發(fā)明是一種快速測定雙殼貝類閉殼肌總類胡蘿素含量的方法，但又不局限 于此一類物種及組織，通過這種技術(shù)可快速、高效地對多種雙殼貝類等物種體內(nèi)的類胡蘿卜 素含量進行研究，對研究類胡蘿卜素在生物體內(nèi)的分布、變化等具有重要的意義。
【附圖說明】
[0033]圖1是實施例1中華貴櫛孔扇貝組織切片的色差檢測結(jié)果-相對紅度Aa-TCC回歸 曲線；
[0034] 圖2是實施例2中合浦珠母貝組織切片的色差檢測結(jié)果-相對紅度Aa-TCC回歸曲 線。
【具體實施方式】
[0035] 以下實施例用于闡明與實施本發(fā)明，屬于