一種高脂樣品中葉黃素含量的定量測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學領(lǐng)域，具體設(shè)及一種高脂樣品中葉黃素含量的定量測定方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葉黃素是一種含紫羅酬環(huán)的二徑基類胡蘿h素，其結(jié)構(gòu)
，分子量為568.85。葉黃素含有二個不同的紫 羅酬環(huán)，護和E-紫羅酬環(huán)，在各紫羅酬環(huán)的第3個C上存在一個功能性徑基，在C-3、C-3'和C-6'處有=個不對稱中屯、，因此理論上有8種立體異構(gòu)體。葉黃素有多種順反異構(gòu)體，自然界 中葉黃素最主要來源是由萬壽菊中提取的，其W反式異構(gòu)體為主要存在形式。但葉黃素在 受到光照、加熱和空氣氧化等作用的影響下，可能會發(fā)生順反異構(gòu)化，產(chǎn)生順式結(jié)構(gòu)的葉黃 素，其分子結(jié)構(gòu)如下：
[0003] 歐盟(Directive 94/36/EC E16化)和美國（21 CFR 73.295)均允許從天然植物中 提取的葉黃素作為食品著色劑使用。我國食品安全國家標準GB 2760《食品添加劑使用標 準》和GB 14480《食品營養(yǎng)強化劑使用標準》中亦允許使用葉黃素作為著色劑在奶粉、冷凍 飲品、賠烤食品等11種食品中W及部分特殊膳食用食品中使用，且針對不同食品，最大使用 量為0.3mg/kg-150mg/kg不等。因此，對食品中添加的葉黃素進行準確定量尤為重要。
[0004] 由于自然界的葉黃素主要W反式異構(gòu)體的形式存在，順式含量低，分離困難，且至 今沒有標準品出售，使得準確定量存在困難。同時，葉黃素為脂溶性物質(zhì)，作為食品添加劑 或營養(yǎng)強化劑添加到含脂量較高的食品如奶粉中時，易與脂類物質(zhì)結(jié)合使得提取困難。此 夕h在葉黃素檢測過程中，溫度、光照等原因均可使反式結(jié)構(gòu)的葉黃素發(fā)生異構(gòu)化，轉(zhuǎn)化為 順式葉黃素，但轉(zhuǎn)化率及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物不確定，也使其準確定量難W進行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種高脂樣品中葉黃素含量的定量測定方法，按本發(fā)明方 法進行測定，可避免測定過程中葉黃素順反異構(gòu)化而造成的測定誤差，在精密度、重現(xiàn)性、 再現(xiàn)性、檢出限等方面均能滿足葉黃素的定量檢測要求，適用于奶粉、冰洪淋等高脂食品中 葉黃素含量的準確測定。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種高脂樣品中葉黃素含量的定量測定方法，其是將光艦異構(gòu)化反應獲得的含順式結(jié) 構(gòu)的葉黃素作為對照品，對樣品測定過程中轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的順式葉黃素進行定性，再采用色譜 歸一化法，根據(jù)反式葉黃素在總?cè)~黃素峰面積中所占比例進行校正，獲得樣品中總?cè)~黃素 含量； 所述局脂食品為脂肪含量局于3%的食品，包括奶粉、冰洪淋。
[0007] 其具體方法包括如下步驟： 1) 對照品的制備：W乙醇為溶劑，將反式葉黃素標準品配制成濃度為800 iig/L的標準 溶液，然后將其與等濃度的艦乙醇溶液按體積比1:20混合，搖勻，于日光或日光燈下放置30 min,獲得作為對照品的含順式結(jié)構(gòu)的葉黃素； 2) 標準曲線的繪制：取5 mg步驟1)所得葉黃素，W含O.lwt% BHT的乙醇溶液溶解并定 容至100 1111^，分別從中準確移取0.050、0.100、0.200、0.400、1.00 1111^于25 1111^棟色容量瓶 中，用含0.1 wt% BHT的乙醇溶液定容至刻度，得到濃度為0.100、0.200、0.400、0.800、2.00 yg/mL的系列標準工作液;將所得標準工作液過0.45皿濾膜后，取續(xù)濾液分別注入液相色譜 中，測定相應的峰面積，然后W標準工作液的濃度為橫坐標，W峰面積為縱坐標，繪制標準 曲線； 3) 樣品的預處理:取2 g待測樣品，加入含O.lwt% BHT的乙醇溶液10 mL，混勻，加入10 mL質(zhì)量濃度10 %的氨氧化鐘溶液，滿旋振蕩1 min混勻，再室溫避光振蕩皂化30 min;然后 WlO mL乙酸-正己燒-環(huán)已燒S元溶劑體系（40:40:20，v/v/v)避光滿旋振蕩提取3 min， 4500 r/min離屯、3 min;重復提取2次后合并提取液，加入10血水，4500 r/min離屯、3 min進 行分層洗涂，重復洗涂1次后合并有機相，室溫減壓濃縮至近干； 4) 含量測定:將步驟3)預處理后的樣品用含O.lwt% BHT的乙醇溶液滿旋振蕩溶解，并 定容至5 mL，過0.45WI1濾膜，取續(xù)濾液進行液相色譜測定;采用色譜歸一化法，根據(jù)反式葉 黃素在總?cè)~黃素峰面積中所占比例進行校正，然后根據(jù)步驟2)所得標準曲線計算樣品中總 葉黃素含量。
[000引其液相色譜條件為:YMC化rotenoid色譜柱，5皿，250 臟X4.6臟;柱溫：30。C; W含0.1 wt% BHT的甲醇/水(88:12，v/v)-含0.1 wt% BHT的甲基叔下基酸為流動相進行梯度 洗脫;流速：1.0 mL/ min;檢測波長:445 nm;進樣量:50化。
[0009] 梯度洗脫的程序為:0-18 min,將流動相中含O.lwt% BHT的甲醇/水的體積由100 〇/〇變換至10 %; 18.1 min,將流動相中含O.lwt% BHT的甲醇/水的體積由10 %變換至100 %， 保留10 min。
[0010] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：按本發(fā)明方法進行測定，可避免測定過程中葉黃素順反 異構(gòu)化而造成的測定誤差，在精密度、重現(xiàn)性、再現(xiàn)性、檢出限等方面均能滿足葉黃素的定 量檢測要求，適用于奶粉、冰洪淋等高脂食品中葉黃素含量的準確測定。
【附圖說明】
[0011] 圖1為經(jīng)光艦異構(gòu)化后葉黃素的液相色譜圖，其中1為順式結(jié)構(gòu)的葉黃素，2為反式 結(jié)構(gòu)的葉黃素。
[0012] 圖2為奶粉中葉黃素的液相色譜圖，其中1為順式葉黃素，2為反式葉黃素。
【具體實施方式】
[0013] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0014] 1試劑與材料 環(huán)已燒、乙酸、正己燒、無水乙醇、甲基叔下基酸、二下基徑基甲苯(BHT)均為色譜純;氨 氧化鐘、艦為分析純；葉黃素 (CAS No. 127-40-2)標準品，純度不低于98.0%，Wo. 1 %冊T乙 醇溶液溶解并配制標準溶液。中性氧化侶固相萃取小柱，500 mg/3 mL，使用前W5 mL萃取 溶劑淋洗，保持柱體濕潤。
[0015] 液相色譜儀，帶二極管陣列檢測器或紫外檢測器;分析天平:感量0.01 mg和0.01 g;組織搗碎機;旋滿振蕩器;振蕩器;減壓濃縮裝置；固相萃取裝置；離屯、機:轉(zhuǎn)速不低于 4500 r/ min。
[0016] 2實驗步驟 2.1對照品的制備： 按參考文獻（《C30柱分離萬壽菊花中的葉黃素類化合物初探》，張艷等，食品科學， 2006，27 (11): 424-428)利用反式葉黃素光艦異構(gòu)化反應制備順式葉黃素，其步驟為：W乙 醇為溶劑，將反式葉黃素配制成濃度為800 iig/L的標準溶液，然后將其與等濃度的艦乙醇 溶液按體積比1:20混合，搖勻，于日光或日光燈下放置30 min，獲得作為對照品的含順式結(jié) 構(gòu)的葉黃素。
[0017] 2.2標準溶液的繪制： 準確稱取5 mg(精確至0.Olmg)步驟1)所得葉黃素，W含0.1 wt% BHT的乙醇溶液溶解并 定容至100血，分別從中準確移取0.050、0.100、0.200、0.400、1.00血于25 1111^棟色容量瓶 中，用含0.1 wt% BHT的乙醇溶液定容至刻度，得到濃度為0.100、0.200、0.400、0.800、2.00 yg/mL的系列標準工作液;將所得標準工作液過0.45皿濾膜后，取續(xù)濾液分別注入液相色譜 中，測定相應的峰面積，然后W標準工作液的濃度為橫坐標，W峰面積為縱坐標，繪制標準 曲線； 2.3樣品前處理 準確稱取2 g(