一種檢測(cè)鎂或鎂合金神經(jīng)毒性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于金屬離子毒性檢測(cè)領(lǐng)域，具體是一種檢測(cè)儀或儀合金神經(jīng)毒性的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，儀及儀合金作為可植入醫(yī)用材料的研究發(fā)展迅猛，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi) 新型生物材料研究的熱點(diǎn)之一。儀合金有良好的力學(xué)性能，與人體骨密度接近；在體內(nèi)完 全可降解，可W減少二次手術(shù)對(duì)患者帶來(lái)的痛苦；降解產(chǎn)生的儀離子是人體必需的陽(yáng)離子 之一，作為骨科植入材料、血管支架材料等有非常好的應(yīng)用前景，最近還擴(kuò)展到外科修復(fù)材 料、口腔修復(fù)材料等領(lǐng)域。但是，儀合金也存在著降解速度過(guò)快，抗腐蝕性能偏低的問(wèn)題。由 此帶來(lái)的主要問(wèn)題是其快速降解產(chǎn)生的腐蝕產(chǎn)物是否有良好的生物相容性。目前的體外生 物相容性研究主要集中成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和血液相容性，但是對(duì)于毒性 更加敏感的神經(jīng)細(xì)胞，卻幾乎沒(méi)有報(bào)道。
[0003] 雖然儀離子是人體內(nèi)的第四大離子，體內(nèi)的可耐受濃度很高。但是儀合金植入體 內(nèi)之后，降解速度較快，將導(dǎo)致植入體周圍局部?jī)x離子及其合金離子濃度突然升高，對(duì)周圍 神經(jīng)存在潛在毒性。并且大量?jī)x離子及其合金離子能夠通過(guò)血液循環(huán)穿過(guò)血腦屏障，對(duì)中 樞神經(jīng)系統(tǒng)也存在潛在危害。而儀合金中其常見(jiàn)的合金元素侶，鋒，裡，儘等都是已知的神 經(jīng)毒性物質(zhì)。在儀及儀合金材料大量進(jìn)入臨床應(yīng)用之前，研究其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響非常有 必要。不僅如此，有人提出將儀合金材料用作神經(jīng)修復(fù)支架材料，并且初步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了 其可行性，因此在儀和儀合金材料大量進(jìn)入臨床應(yīng)用之前，非常有必要研究其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞 的潛在影響。
[0004] 根據(jù)ISO10993W及GB/T16886規(guī)定，生物材料細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法有直接接觸 法和浸提法。儀合金材料在植入體內(nèi)之后會(huì)產(chǎn)生電化學(xué)腐蝕，有劇烈的化學(xué)反應(yīng)并伴隨著 pH值升高和氨氣產(chǎn)生，研究表明儀合金材料不適用直接接觸法，而需要采用浸提法。
[000引MTT法是目前應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞活性研究方法，但是MTT法干擾因素較多，容易 造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不夠穩(wěn)定。
[0006] 體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞可W自發(fā)的形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)并且產(chǎn)生穩(wěn)定的電生理信號(hào)。微電 極陣列（MEA)是最近發(fā)展起來(lái)的可W非侵入性的、實(shí)時(shí)的、長(zhǎng)期的檢測(cè)神經(jīng)電生理信號(hào)的技 術(shù)。將體外培養(yǎng)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和微電極陣列結(jié)合形成的生物傳感器近年來(lái)被廣泛用于藥物和 化合物質(zhì)的電生理神經(jīng)毒性的檢測(cè)。由于MEA生物傳感器可W實(shí)現(xiàn)高通量，高輸出的檢測(cè)， 并且其得到的檢測(cè)結(jié)果跟體內(nèi)試驗(yàn)有很好的一致性，被稱作"二十一世紀(jì)生理學(xué)神經(jīng)毒性 的檢測(cè)平臺(tái)"。雖然MEA已經(jīng)廣泛用于藥物的神經(jīng)生理學(xué)檢測(cè)，但是對(duì)于生物材料的檢測(cè)還 未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)果穩(wěn)定的檢測(cè)儀或儀合金神經(jīng)毒性的方法。
[0008] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案： 一種檢測(cè)儀或儀合金神經(jīng)毒性的方法，所述方法包括：用LDH法檢測(cè)細(xì)胞活性；W及， 用雞胚前腦神經(jīng)元-微電極陣列生物傳感器檢測(cè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電生理信號(hào)。
[0009] 進(jìn)一步地，所述用LDH法檢測(cè)細(xì)胞活性包括W下步驟： 51、 配制儀離子溶液、制備儀或儀合金的浸提液； 52、 用化urobasal培養(yǎng)液培養(yǎng)雞胚前腦神經(jīng)元； 53、 往雞胚前腦神經(jīng)元加入儀或儀合金的浸提液，用LDH檢測(cè)細(xì)胞活性。
[0010] 進(jìn)一步地，所述S1具體為： 511、 將儀或儀合金的試樣置于密封的離屯、管，加入化urobasal培養(yǎng)液浸提； 512、 24h后取出試樣，浸提液離屯、后取上清； 513、 檢測(cè)浸提液的抑值和儀離子濃度； 514、 浸提液經(jīng)濾膜過(guò)濾、稀釋后保存?zhèn)溆谩?br>[0011] 進(jìn)一步地，所述S2具體為： 521、 種細(xì)胞前一天，將96孔板鋪上聚乙締亞胺； 522、 獲取雞胚前腦組織，用邸TA膜酶消化，再吹打成單細(xì)胞懸液，然后離屯、棄去上清， 加M199培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，并加入96孔板，置于培養(yǎng)箱； 523、 24h后將M199培養(yǎng)液全部換成化urobasal培養(yǎng)液； 524、 第3天加入阿糖胞巧。
[0012] 進(jìn)一步地，所述獲取雞胚前腦組織具體為： 5221、 取第7~9天的受精雞蛋，消毒，用綴子將雞蛋頭部敲碎，去殼，撥開(kāi)殼膜，取出雞 胚放到裝有皿SS的培養(yǎng)皿； 5222、 用綴子將雞胚的頭截?cái)?，放入另一個(gè)有皿SS的培養(yǎng)皿； 5223、 加雞胚的頭部背面朝上置，壓住中腦部位，并把前腦的腦膜掲開(kāi)，取出兩團(tuán)白色 的組織，放于有皿SS的培養(yǎng)皿，將貼附在白色組織外面殘余的腦膜去掉，得到雞胚前腦組 織。
[0013] 進(jìn)一步地，所述S3具體為：雞胚前腦神經(jīng)元培養(yǎng)至第五天時(shí)棄去全部上清液，加 入儀離子溶液或者浸提液，分別于第6、8、10天進(jìn)行LDH檢測(cè)。
[0014] 進(jìn)一步地，所述LDH檢測(cè)具體為：從96孔板吸取上清液到一個(gè)新的96孔板，每 孔加入反應(yīng)緩沖液，在室溫暗處放置30min，然后加入停止液混勻，W490皿為測(cè)定波長(zhǎng)， 680nm為參比波長(zhǎng)，利用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度值，計(jì)算LDH的相對(duì)釋放率。
[0015] 進(jìn)一步地，所述用雞胚前腦神經(jīng)元-微電極陣列生物傳感器檢測(cè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電生理 信號(hào)包括W下步驟： 55、 制備儀或儀合金的浸提液； 56、 將化urobasal培養(yǎng)液加入微電極陣列，微電極陣列置于培養(yǎng)箱，記錄信號(hào)； 57、 當(dāng)電信號(hào)達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)時(shí)，連續(xù)Ξ天，每天測(cè)量平衡時(shí)電信號(hào)30min; 58、 第Ξ天時(shí)，將四分之一的化urobasal培養(yǎng)液換成浸提液，再連續(xù)測(cè)量Ξ天電信號(hào)， 每天測(cè)量30min; 59、 第六天時(shí)，將培養(yǎng)液全換成普通培養(yǎng)液，連續(xù)測(cè)量Ξ天電信號(hào)，每天30min。
[0016] 本發(fā)明具有W下有益效果： 本發(fā)明WLDH法和雞胚前腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)-微電極陣列生物傳感器為基礎(chǔ)，建立了檢測(cè)儀 或儀合金神經(jīng)毒性的方法，該方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，操作簡(jiǎn)便，效率高，是一種高通量的 檢測(cè)方法。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是儀離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活性的濃度-效應(yīng)曲線； 圖2是100%浸提液對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活性的檢測(cè)結(jié)果； 圖3是50%浸提液對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活性的檢測(cè)結(jié)果； 圖4是25%浸提液對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活性的檢測(cè)結(jié)果； 圖5是連續(xù)Ξ天作用25%浸提液或3mM儀離子對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)峰電位頻率的影響； 圖6是連續(xù)Ξ天作用25%浸提液或3mM儀離子對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)頻率的影響； 圖7是連續(xù)Ξ天作用25%浸提液或3mM儀離子對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)峰電位占爆發(fā)百分比的影 響； 圖8是連續(xù)Ξ天作用25%浸提液或3mM儀離子對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)長(zhǎng)度的影響； 圖9是連續(xù)Ξ天作用25%浸提液或3mM儀離子對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)爆發(fā)里峰電位頻率的影響； 圖10是連續(xù)Ξ天作用25%儀合金浸提液或3mM儀離子對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)峰電位振幅的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明： 實(shí)施例1 配制儀離子溶液 稱取1.015g MgCl2'6H2〇(M2670，Sigma)，溶于50血雞胚前腦組織神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基(無(wú) 血清）中，得到lOOmM的儀離子溶液，分別稀釋不同倍數(shù)得到30mM、10mM、3mM、lmM、0. 3mM、 0.ImM儀離子的溶液，4°C冰箱中冷凍待用。
[0019] 制備儀或儀合金的浸提液 (1)將打磨至2000#的鑄態(tài)純儀和肥43 (湖南稀±金屬研究院，1. 5cmX1. 5cmX1cm)， 在乙醇(分析純）中超聲清洗20分鐘，于超凈臺(tái)內(nèi)室溫干燥。
[0020] (2)將試樣置于能密封的離屯、管內(nèi)，按浸提液與表面積之比為3cm2AiL的比例加入 雞胚前腦神經(jīng)元培養(yǎng)液（Neurobasal，2%B27,l%GluMax，0. 25%雙抗)，置于37°C的培養(yǎng)箱中 浸提24h。
[0021] (3) 24小時(shí)后取出，并W2000巧m的速度離屯、5min，取出上清液。
[0022] (4)用抑儀檢測(cè)浸提液的抑值，上清液稀釋10倍后用電感禪合等離子體原子發(fā) 射光譜法（ICP-AES，0ptima5300DV，化rki址lmer，USA)檢測(cè)儀離子濃度。
[0023] (5)用于細(xì)胞培養(yǎng)的浸提液采用00. 22μm濾膜過(guò)濾，用普通細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到 50%、25%，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆?，時(shí)間不超過(guò)1周。
[0024] 培養(yǎng)雞胚前腦神經(jīng)元 (1)種細(xì)胞前一天，將96孔板（Corning)鋪上50μL0. 05%w/v聚乙締亞胺（PEI，Sigma),置于37°C培養(yǎng)箱過(guò)夜，第二天吸去上清液，并用去離子水洗Ξ遍，在超凈臺(tái)內(nèi)吹干 待用。 陽(yáng)ο巧](2)取第7天到第9天的白色來(lái)航雞受精雞蛋，噴70%酒精消毒，將所有解剖用具 放入解剖超凈臺(tái)。
[00%] (3)用純的中號(hào)綴子將雞蛋頭部(大頭）敲碎，并且小屯、地去掉蛋殼，撥開(kāi)殼膜，取