用于抗因子Xa試驗通用校準(zhǔn)的工具和方法
【專利說明】用于抗因子Xa試驗通用校準(zhǔn)的工具和方法
[0001] 本發(fā)明涉及凝固試驗領(lǐng)域的診斷工具和方法。具體地，涉及測定在受試者樣品中 由第一抗凝劑引發(fā)的抗凝劑活性的方法，包括測量所述受試者的體液試驗樣品中的第一因 子Xa活性，測量至少一種基準(zhǔn)樣品中的第二因子Xa活性，所述基準(zhǔn)樣品包含第二抗凝劑預(yù) 定的抗凝活性，基于第一和第二測量的因子Xa活性計算試驗樣品中包含的抗凝活性的通 用參數(shù)，將抗凝活性的所述參數(shù)與至少三種抗凝劑的預(yù)期抗凝活性的預(yù)定范圍相比較。本 發(fā)明還提供了協(xié)助該方法的計算機程序代碼，以及實施所述方法的系統(tǒng)和試劑盒。
[0002] 任何較大的生物體均具有血液循環(huán)系統(tǒng)，其為不同的器官帶來氧氣和營養(yǎng)，并處 理掉二氧化碳和廢物。然而為了血液循環(huán)系統(tǒng)能夠工作，血管中的損傷必須快速有效地閉 合。此功能是由血液凝固系統(tǒng)完成的，其為能夠使血液形成血小板聚集物和纖維蛋白凝膠 的復(fù)雜機制，后者能夠擬合閉合血管損傷。
[0003] 然而，血液凝固不僅會導(dǎo)致止血，即血管損傷的閉合，還會導(dǎo)致血栓形成和栓塞， 即血管被血塊關(guān)閉。血栓形成和栓塞可以有許多表現(xiàn)，例如腿中的靜脈血栓形成，肺栓塞， 心肌梗塞和中風(fēng)。因此血液凝固系統(tǒng)是重要的挽救生命的過程，但是如果血液凝固閉合了 重要的血管，其也可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致患者死亡。
[0004] 血液凝固系統(tǒng)中涉及的一個機制是凝血因子級聯(lián)，其為一系列絲氨酸蛋白酶類， 經(jīng)連續(xù)活化，并最終導(dǎo)致形成凝血酶一一血液凝固系統(tǒng)的核心酶。凝血酶能夠?qū)⒗w維蛋白 原分解為纖維蛋白，其脫落，聚合為纖維蛋白纖維，纖維蛋白纖維形成纖維蛋白凝塊。凝血 酶還活化輔因子，輔因子加速自身的產(chǎn)生（因子V和因子VIII)，活化因子XIII-一一種轉(zhuǎn) 谷氨酰胺酶，其交聯(lián)，從而穩(wěn)定纖維蛋白凝塊，凝血酶還是血小板的有力活化劑。
[0005] 當(dāng)個體衰老，并由于風(fēng)險因子（例如糖尿病、肥胖、吸煙和遺傳風(fēng)險因子）加速衰 老，血栓形成事件的風(fēng)險也逐漸增加。因此已研發(fā)抑制凝固系統(tǒng)的藥物，即所謂的抗凝劑。 最成功的抗凝劑類藥物之一是因子Xa的抑制劑，因子Xa是一種將凝血酶原活化為凝血酶 的絲氨酸蛋白酶。因子Xa的形成是緊鄰凝血酶活化之前的步驟。
[0006] 因子Xa被幾種不同藥物抑制，例如低分子量肝素，戊多糖，利伐沙班 (Rivaroxaban)、阿哌沙班（Apixaban)、和未分級分離的（unfractionated)肝素。這些藥 物具有不同的結(jié)構(gòu)、分子、以及機制，但它們共有相同的特征，即它們?nèi)紝?dǎo)致因子Xa的抑 制，從而導(dǎo)致凝血酶產(chǎn)生的減少。
[0007] 針對因子Xa的多數(shù)藥物通常非常安全，不需要在臨床應(yīng)用中對其效果進行常規(guī) 監(jiān)測。但仍然會有期望能夠測量這些藥物活性的情況：例如當(dāng)治療醫(yī)生懷疑患者可能不會 按時按量服藥，而想要控制藥物水平，或如果患者患有可能導(dǎo)致藥物在循環(huán)中累積的疾病， 從而導(dǎo)致出血并發(fā)癥，或在十分年老的患者、兒童或嚴(yán)重肥胖的患者中，或在患者接受抗凝 劑治療期間經(jīng)歷并發(fā)癥（即出血或血栓形成）的患者中，醫(yī)生想要厘清當(dāng)前的抗凝狀態(tài)。
[0008] 通常使用兩種總體測定法測量凝血因子的活性：凝血酶原時間（PT)和激活的部 分促凝血酶原激酶時間（aPTT)。兩種測定法中均在開始時刺激凝固級聯(lián)（在PT中通過組 織因子，在aPTT中通過接觸活化劑進行），在一系列酶促反應(yīng)之后，凝血酶形成，樣品凝固。 試驗開始和樣品凝固之間的時間為凝固時間，其指示凝血因子的活性。然而在兩種測定法 中，因子Xa的形成均僅為許多步驟中的一步，因此aPTT和PT對于因子Xa的多數(shù)抑制劑靈 敏度低，并對實際藥物活性的定量能力差（見例如EP 1 734 369 Al)。
[0009] 已研發(fā)了定量因子Xa抑制的更具特異性的方法。測量因子Xa抑制的測定法也稱 為一抗Xa試驗Il或一抗因子Xa試驗Il。這樣的抗因子Xa試驗的共同特征在于將樣品加 入兩種試劑：一種包含因子Xa，一種包含可被因子Xa分解的肽底物。之后記錄反應(yīng)溶液中 肽底物經(jīng)由因子Xa的轉(zhuǎn)化。肽底物包含某個氨基酸序列，使其可以被因子Xa切割，其中轉(zhuǎn) 化速度與樣品中因子Xa的活性成比例。當(dāng)?shù)孜锉灰蜃覺a分解，則介導(dǎo)信號反應(yīng)，其由分析 器測量，該分析器實施所述抗Xa試驗。通常提供可檢測標(biāo)記的化學(xué)基團（例如色原或熒光 團）與肽底物共價結(jié)合。當(dāng)使用這樣的產(chǎn)色肽底物時，釋放改變?nèi)芤侯伾幕鶊F，其可用光 度計測量。當(dāng)使用生熒光的底物時，釋放熒光基團，對反應(yīng)進行電化學(xué)測量時，因子Xa對底 物的分解導(dǎo)致反應(yīng)溶液離子結(jié)構(gòu)的改變。不同底物的共同特征是，在每個情況中樣品中均 發(fā)生信號反應(yīng)，其與樣品中因子Xa的濃度成比例，并有分析器記錄。
[0010] 在向樣品中加入含因子Xa的試劑和加入含底物的試劑之間，可以有溫育步驟，使 得樣品中的因子Xa抑制劑可以抑制因子Xa。但也有不用這樣的溫育步驟的測定法。任選 地，還可加入影響測定法特異性的其他物質(zhì)，例如硫酸葡聚糖或抗凝血酶。
[0011] 因此測定法的結(jié)果是吸光度的變化，或吸光度變化的速度（或熒光或任何其他所 使用的信號反應(yīng)）。為簡單起見，認為信號反應(yīng)是以mE(毫單位消光）表達的吸光度變化。
[0012] 如本領(lǐng)域公知，使用此吸光度，用校準(zhǔn)曲線計算抗凝劑濃度。當(dāng)僅在治療上應(yīng)用 2類因子Xa抑制劑（即未分級分離的肝素（UFH)和低分子量肝素（LMffH))時研發(fā)了此程 序。通常，用定標(biāo)物完成單獨的校準(zhǔn)曲線，其包含漸增劑量的LMffH或UFH，測量這些定標(biāo)物 之后，分析器確定校準(zhǔn)曲線，以從血漿樣品中測定的吸光度值計算抗凝劑濃度。
[0013] 同時，已向臨床實踐中引入了若干其他因子Xa抑制劑，針對例如利伐沙班、戊多 糖、達那肝素（Danaparoid)的定標(biāo)物和對照也是可獲得的。
[0014] 如今在任何較大的醫(yī)院，均同時使用多種不同的抗凝劑。一些患者可能在住院期 間接受LMffH以預(yù)防深部靜脈血栓形成（DVT)，其他患者可能接受利伐沙班以預(yù)防心房顫動 導(dǎo)致的中風(fēng)，其他患者接受戊多糖以預(yù)防髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)中的DVT，而重癥監(jiān)護病房（ICU) 的患者可能接受使用未分級分離的肝素的治療。
[0015] 臨床過程通常如下：輔助人員（例如抽血師、護士或較年輕的醫(yī)師之一）準(zhǔn)備采血 管用于采血，并填好說明需實施哪些測定的各個預(yù)訂表格。采集血液，與預(yù)訂表格一起送到 化驗室。如果預(yù)訂了 LMWH、UFH、利伐沙班或阿哌沙班試驗，則實施抗因子Xa試驗，并基于 各校準(zhǔn)曲線計算抗凝劑濃度。而后該濃度通過化驗室信息系統(tǒng)（laboratory information system，LIS)遞交給治療醫(yī)生，該系統(tǒng)通常通過內(nèi)部網(wǎng)、或傳真、信件或其他信息手段可得。 [0016] 然而，此預(yù)訂測定法、校準(zhǔn)、和結(jié)果表達的程序有若干缺陷。這些限制影響程序的 效率，且產(chǎn)生醫(yī)療風(fēng)險。
[0017] 例如，對于單個診斷方法（抗因子Xa-試驗）需使用若干組定標(biāo)物和對照十分麻 煩、昂貴且對化驗室檢查增加復(fù)雜性。設(shè)想如果每個化驗室試驗均需要若干不同的校準(zhǔn)、對 照和技術(shù)檢驗程序（proficiency testing procedure)，可想而知這將對化驗室分析所涉 及的努力和化驗室花費增加很大的負擔(dān)。
[0018] 此外還涉及風(fēng)險，尤其是以下實例：如前所述血液試驗的預(yù)訂表格通常不是由治 療醫(yī)生本人所填，而是由醫(yī)學(xué)教育水平或經(jīng)驗較低的輔助人員（護士、抽血師、年輕醫(yī)生） 所填。如果現(xiàn)在輔助人員不小心預(yù)訂了一LMffH Il試驗，而患者接受利伐沙班，化驗室將報告 LMffH濃度，盡管患者可能從未用此藥物治療過。這意味著化驗室結(jié)果的表達比分析方法本 身更具特異性。所測量的是因子Xa抑制。然而，報告的卻是具體藥物的濃度。另一種情況 下，有可能評估患者的化驗值的醫(yī)生會看到血小板計數(shù)降低，同時看到一定的LMffH濃度。 該醫(yī)生可能因此將此結(jié)果誤解為肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥。問題不僅僅在于錯誤的訂單通 過此過程傳播，而是一開始的錯誤信息通過該鏈被過高評價。如果護士告知醫(yī)生該患者接 受了 LMWH，醫(yī)生可能會仔細檢查該信息。然而如果醫(yī)生從化驗室的正式報告收到一 LMffH濃 度Il，上面有負責(zé)的化驗室人員簽名，那么他會認為此信息是正確的。
[0019] 因此當(dāng)前的診斷程序涉及校準(zhǔn)程序的非常早期選擇，其在很晚之后的診斷過程中 應(yīng)用，用于校準(zhǔn)的藥物的錯誤選擇在整個診斷過程中傳播，并被過高評價。診斷程序涉及 一般性測量步驟（即因子Xa抑制），而校準(zhǔn)步驟（針對各抗凝劑）對于使用者并不明確。 校準(zhǔn)程序是僵化的，即一旦報告了結(jié)果，就無法改變校準(zhǔn)，即使在過程早期就選擇了錯誤 的藥物（Favaloro2011，Pathology，Dec ;43 (7) :682-92 ;Tripodi 2013，Clin Chem，F(xiàn)eb ; 59 (2) : 353-62 ;和 Gehrie 2012, Am J Hematol.，F(xiàn)eb ;87 (2) : 194-6) ·
[0020] 本發(fā)明所面對的技術(shù)問題可視為提供滿足上述需求的工具和方法。所述技術(shù)問題 由權(quán)利要求書和下文中描述的實施方案解決。
[0021] 因此，本發(fā)明涉及測定在受試者樣品中由第一抗凝劑引發(fā)的抗凝劑活性的方法， 包含：
[0022] (a)測量所述受試者的體液試驗樣品中的第一因子Xa活性；
[0023] (b)測量包含第二抗凝劑預(yù)定的抗凝活性的至少一種基準(zhǔn)樣品中的第二因子Xa 活性；
[0024] (C)基于第一和第二測量的因子Xa活性計算試驗樣品中包含的抗凝活性的通用 參數(shù)；和
[0025] (d)將抗凝活性的所述參數(shù)與至少三種抗凝劑的預(yù)期抗凝活性的預(yù)定范圍相比 較，以確定抗凝劑活性。
[0026] 本發(fā)明的方法優(yōu)選為離體方法，即其在體外使用來自受試者的分離樣品進行。此 外，可以包含上文詳述的步驟之外的步驟。例如，其他步驟可涉及樣品預(yù)處理或評估由所述 方法得到的結(jié)果。所述方法可人工實施或經(jīng)自動化輔助。步驟（a)，和/或（b)可全部或部 分由自動化輔助，例如分別為，使用適當(dāng)?shù)臋C器人和感知設(shè)備用于在步驟（a)和/或（b)中 的測定，和在步驟（C)和（d)中在數(shù)據(jù)處理設(shè)備上使用計算機執(zhí)行的計算或比較算法。優(yōu) 選至少步驟c)和d)用計算機執(zhí)行的算法進行。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明所使用的術(shù)語一測定抗凝劑活性Il指定性、定量或半定量地測定抗 凝劑活性在受試者樣品中的存在?？鼓齽┗钚灾富衔锓乐够蛞种蒲耗痰哪芰Γ绫?文他處更詳細說明的。本發(fā)明的方法可以定量或半定量地測定樣品中存在的抗凝活性的 量。此外，通過將從抗凝活性衍生的參數(shù)與給定抗凝劑的預(yù)期抗凝活性的預(yù)定義范圍相比 較，還可以鑒定在樣品中引發(fā)抗凝劑活性的抗凝劑，即定性地測定（或鑒定）抗凝劑活性。
[0028] 如此處所使用的術(shù)語一抗凝劑Il指能夠防止或抑制血液凝固的化合物。血液凝 固是熟知的過程，其中由血液形成纖維蛋白凝塊，以避免由于例如血管損傷導(dǎo)致的失血。血 液凝固是涉及眾多酶類和輔助物質(zhì)的過程。為形成纖維蛋白凝塊，纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維 蛋白，后者隨后相互交聯(lián)。纖維蛋白原和致使交聯(lián)的酶一一因子XIIIa均由蛋白酶凝血酶 酶促活化。凝血酶本身由因子Xa活化，后者則由組織因子/因子Vila復(fù)合物或因子IXa/ 因子VIIIa復(fù)合物活化。因子VIIa、VIIIa和IXa也在血液凝固過程中依次從其前體活化。 由于這些酶以分級順序彼此活化，這些酶的整體有時也稱作凝固級聯(lián)。多種化合物已被描 述為抗凝劑，其影