一種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米功能材料以及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA等常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于肝癌的診斷都能起到一定的作用。對(duì)于腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)方法很多，如放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶標(biāo)記免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光分析法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法等，但多數(shù)檢測(cè)方法繁瑣，操作復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，檢出限高，因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法有重要意義。
[0003]與其他檢測(cè)CEA、AFP的方法相比較，該傳感器具有更低的檢測(cè)線和超高的靈敏度。無(wú)標(biāo)型電化學(xué)免疫傳感器結(jié)合了高特異性的免疫分析技術(shù)和高靈敏的電化學(xué)分析技術(shù)，具有靈敏度尚、制備簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、成本低、等優(yōu)點(diǎn)，在臨床檢驗(yàn)、食品安全控制、生物監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用價(jià)值。而構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器的關(guān)鍵有兩點(diǎn):其一是采用簡(jiǎn)單、快速、有效的方法將抗原抗體等生物分子固定在電極表面；其二是開(kāi)發(fā)傳感器的信號(hào)放大技術(shù)。
[0004]Au/Ag iFe304-GS @Cd2+具有良好的導(dǎo)電性能，極大的比表面積，因而具有很多活性位點(diǎn)可以很好的固載抗體，能夠加速電子傳遞，鎘離子能夠傳遞電子，促進(jìn)雙氧水的催化，促進(jìn)產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。從而Au/Ag iFe304-GS @Cd2+能夠促進(jìn)多重的信號(hào)放大，對(duì)于傳感器的構(gòu)建以及實(shí)現(xiàn)高靈敏度以及低檢測(cè)限具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤標(biāo)志物的超靈敏檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器的制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的之二是將所制備的一種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器，用于檢測(cè)肝癌腫瘤標(biāo)志物。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟:
1.一種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器的制備方法，步驟如下:
(1)將直徑為3~5mm的玻碳電極用A1203拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將6μ?、1 ~ 3 mg/mL的金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子Au/Ag @Fe304_GS iCd2+溶液滴涂于電極表面上，室溫下晾干；
(3)將6μ?,8 ~ 12 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體溶液滴加到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；
(4)繼續(xù)將3PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5-2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(5)滴加6 μ?、0.05pg/mL~ 50 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥，制得一種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器。
[0009]2.Au/Ag iFe304-GS @Cd2+溶液的制備步驟:
(1)磁性石墨烯Fe304-GS的制備
將0.5-0.7g FeCl3.6Η20溶解于10mL的乙二醇中，后將1.4-1.6g的乙酸鈉，5mL的乙二胺和0.5g的氧化石墨烯加入上述溶液中，磁力攪拌30min后，將該混合液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，加熱至180~220°C，反應(yīng)6~10小時(shí)；后冷卻至室溫，用50 mL的超純水和無(wú)水乙醇清洗干凈；獲得的產(chǎn)物在50°C干燥，制得磁性石墨烯Fe304-GS ;
(2)Au/Ag @Fe304-GS 的制備
取0.1-0.2g的GS-Fe304加入到10mL的無(wú)水甲苯中，加入0.2mL的3 -氨丙基三乙氧基硅烷，70 °C下加熱回流1.5h，磁分離干燥后得到氨基化磁性石墨烯NH2- GS-Fe304j_5~15mg的氨基化磁性石墨烯NH2-Fe304-GS加入到50mL金銀核殼納米粒子溶液中，振蕩24h，磁分離，80 °C 下干燥，得到 Au/Ag @Fe304_GS ；
所述的金銀核殼納米粒子溶液是將0.4-0.6mL、10mmol/L的AgN03溶液和0.8-1.2mL、0.1mol/mL的抗壞血酸加入到20mL、50mmol/mL的表面活性劑CTAB中混合均勾，后再加入2mL的金納米粒子，逐滴加入0.lmL、濃度為lmol/L的NaOH于上述溶液中，反應(yīng)lmin，溶液由酒紅色逐漸變?yōu)辄S色得到金銀核殼納米粒子溶液；
所述的金納米粒子溶液是將100mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的HAuC14溶液加熱至沸騰，加入2.5 mL、10mg/mL的梓檬酸鈉溶液，回流20min，后冷卻至室溫，得到酒紅色的金納米粒子溶液；
(3)Au/Ag iFe304-GS iCd2+ 溶液的制備
將4~6 mg的Au/Ag iFe304-GS加入到4 mL、2 mg/mL的硫酸鎘溶液中，震蕩24h，使Au/Ag@GS-Fe304吸附Cd2+，磁分離后，分散到2 mL的超純水中，制得Au/Ag iFe304-GS @Cd2+溶液。
[0010]3.腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測(cè)試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.6~ 8.1磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試；
(2)用計(jì)時(shí)電流法對(duì)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 s，運(yùn)行時(shí)間 400 s ；
(3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH=6.8磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL、5 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。
[0011]上述腫瘤標(biāo)志物選自下列之一:AFP、CEA。
[0012]本發(fā)明所用原材料均可在化學(xué)試劑公司或生物制藥公司購(gòu)買。
[0013]本發(fā)明的有益成果
(1)采用Cd2+@Au/Ag@Gs- Fe304作為基質(zhì)材料，石墨稀具有大的比表面積以及良好的導(dǎo)電能力，且對(duì)過(guò)氧化氫有催化作用，Cd2+，Au和Ag對(duì)過(guò)氧化氫也有催化作用，能夠促進(jìn)多重的信號(hào)放大，因此提高了傳感器的靈敏度，降低了檢測(cè)限；
(2)—種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器用于對(duì)不同腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，其對(duì)癌胚抗原CEA的線性范圍0.05 pg/mL?50 ng/mL，檢測(cè)限0.017 pg/mL ;對(duì)甲胎蛋白AFP的線性范圍0.1 pg/mL?50 ng/mL，檢測(cè)限0.034 pg/mL，表明一種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器可以達(dá)到準(zhǔn)確測(cè)定的目的。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1一種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器的制備
(1)將直徑為3mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將6μ?、1 mg/mL的金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子Au/Ag OFe3O4-GS OCd2+溶液滴涂于電極表面上，室溫下晾干；
(3)將6μ?,8 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體溶液滴加到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；
(4)繼續(xù)將3PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?、0.05pg/mL~ 50 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥，制得一種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器。
[0015]實(shí)施例2—種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器的制備
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將6μ?、2 mg/mL的金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子Au/Ag OFe3O4-GS OCd2+溶液滴涂于電極表面上，室溫下晾干；
(3)將6μ?, 10 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體溶液滴加到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；
(4)繼續(xù)將3PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?、0.05pg/mL~ 50 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥，制得一種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器。
[0016]實(shí)施例3—種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器的制備
(1)將直徑為5mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將6μ?、3 mg/mL的金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子Au/Ag OFe3O4-GS OCd2+溶液滴涂于電極表面上，室溫下晾干；
(3)將6μ?, 12 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體溶液滴加到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；
(4)繼續(xù)將3PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?、0.05pg/mL~ 50 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥，制得一種基于金銀核殼磁性石墨烯吸附鎘離子免疫傳感器。
[0017]實(shí)施例4 Au/Ag iFe304-GS @Cd2+溶液的制備
(1)磁性石墨烯Fe304-GS的制備
將0.5g FeCl3.6H20溶解于10mL的乙二醇中，后將1.4g的乙酸鈉，5mL的乙二胺和0.5g的氧化石墨烯加入上述溶液中，磁力攪拌30min后，將該混合液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，加熱至180°C，反應(yīng)10小時(shí)；后冷卻至室溫，用50 mL的超純水和無(wú)水乙醇清洗干凈；獲得的產(chǎn)物在50°C干燥，制得磁性石墨烯Fe304-GS ;
(2)Au/Ag @Fe304-GS 的制備
取0.lg的GS_Fe304加入到10mL的無(wú)水甲苯中，加入0.2mL的3 -氨丙基三乙氧基娃烷，70°C下加熱回流1.5h，磁分離干燥后得到氨基化磁性石墨烯NH2- GS-Fe304^# 5mg的氨基化磁性石墨稀NH2-Fe304-GS加入到50mL金銀核殼納米粒子溶液中，振蕩24h，磁分離，80 °C 下干燥，得到 Au/Ag iFe304-GS