檢測(cè)血液中半乳凝集素-1的方法及所用試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于檢測(cè)血液中半乳凝集素-1 (galectin-l)的方法及所用試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是一種嚴(yán)重威脅全球人類生命和健康的疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年全球約 有 700 多萬人死于癌癥（六111116(1;[11，]\，1^&6(^&3.31丨2&&61:11?.，]^〇，￥.?.，乂11，工 Q. ,Taylor,M. ,Michael,J.T.CancerStatistics,CA:CancerJ.Clin. 2008, 58, 71-96) 〇 我國癌癥發(fā)病率呈直線上升趨勢(shì)，并且大量患者就診時(shí)已處于中晚期，基本喪失了治愈的 可能。中晚期癌癥患者難治愈的一個(gè)重要原因是癌癥易發(fā)生轉(zhuǎn)移。原發(fā)腫瘤可進(jìn)行手術(shù) 切除或放射治療，但已散播的癌癥卻往往難以用上述手段治療而不損傷正常組織。腫瘤 的轉(zhuǎn)移伴隨著不良的預(yù)后效果和低的生存率，若能研發(fā)有效的檢測(cè)手段對(duì)其進(jìn)行早期監(jiān) 測(cè)，則有助于轉(zhuǎn)移事件的及時(shí)發(fā)現(xiàn)和盡早干預(yù)，有利于延長患者壽命和提高生活質(zhì)量（廖 子君，雷光焰，張冠軍，劉文超，李洪勝，余國政，腫瘤轉(zhuǎn)移學(xué)，陜西科學(xué)技術(shù)出版 社，2007，p322-p331)。
[0003] 腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)過程，在這個(gè)復(fù)雜的過程中，腫瘤細(xì)胞往往需要大量 表達(dá)某些特異性蛋白（如整合素、鈣粘素、免疫球蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶、纖溶酶激活因子、 血管生長因子等）來實(shí)現(xiàn)降解細(xì)胞外基質(zhì)、侵襲鄰近細(xì)胞層、誘導(dǎo)癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、逃避免疫 系統(tǒng)攻擊、促進(jìn)新血管生成以及轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞增殖等功能（曾益新，呂有勇，朱明華，陳 國強(qiáng)，龔建平，郭朱明，腫瘤學(xué)（第三版），人民衛(wèi)生出版社，2012，p241-p252)。某些 分泌蛋白可能進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在血液中被檢測(cè)到，成為腫瘤轉(zhuǎn)移的有效生物標(biāo)志物，對(duì)這 些生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)可以幫助實(shí)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的及早診斷，成為腫瘤轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的重要手 段（Xue，H.，Li,B.J.，Zhang,J.，Wu，M.，Huang,Q.，Wu，Q.，Sheng，H.，Wu，D.，Hu,J.，Lai,M. ,IdentificationofSerumBiomarkersforColorectalCancerMetastasisUsinga DifferentialSecretomeApproach.J.Proteome.Res.，2010, 9, 545-555)〇
[0004] 半乳凝集素-1 (galectin-l)是一種重要的血清標(biāo)記物，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、 轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫逃逸等方面發(fā)揮重要作用（Liu, F. T.，Rabinovich, G. A. Galectins as Modulators of Tumor Progression. Nature Reviews Cancer. 2005, 5, 29-41)〇大 量研究表明，galectin-l在多種腫瘤（肺癌、肝癌、胃癌、宮頸癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 黑色素瘤等）中均有過表達(dá)，其表達(dá)水平和正常人相比明顯的升高（Kuo，P.L.，Hung，J. Y. , Huang, S. K. , Chou, S. H. , Cheng, D. E. , Jong, Y. J. , Hung, C. H. , Yang, C. J. , Tsai, Y. M. , Hsu,Y.L., Huang, M. S. , Lung Cancer-Derived Galectin-lMediates Dendritic Cell Anergy through Inhibitor of DNA Binding 3/IL-lOSignaling Pathway. J. Immunol. 2011, 186, 1521-1530；Chen, J. , Tang, d. , Wang, S. , Li, Q. G. , Zhang, J. R. , Li ,P. , Lu, Q. , Niu, G. , Gao, J. , Ye, N. Y. , Wang, D. R. , High Expressions of Galectin-land VEGF are Associated with Poor Prognosis in Gastric Cancer Patients, Tumor Biol. 2014, 35, 2513-2519)。同時(shí)，作為一種過度表達(dá)的物質(zhì)，galectin-l會(huì)分泌到腫瘤基 質(zhì)和人體血液中發(fā)揮其作用，因此galectin-1可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)血清標(biāo)記物。對(duì)血 液中的galectin-Ι進(jìn)行檢測(cè)，有可能成為腫瘤轉(zhuǎn)移早期監(jiān)測(cè)的一種新型手段。然而，盡管 癌癥患者的血液galectin-Ι濃度比正常人要高，但其絕對(duì)含量仍然非常低（ng/ml級(jí)別）， 目前尚缺乏有效且方便地檢測(cè)方法，對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移的早期檢測(cè)及干預(yù)治療幫助不大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中缺乏有效地檢測(cè)血液中半乳凝集 素-1 (galectin-Ι)的現(xiàn)狀，提供一種有效且方便地檢測(cè)血液中g(shù)alectin-Ι的方法，提高檢 測(cè)靈敏度和特異性，以為癌癥轉(zhuǎn)移的早期檢測(cè)及干預(yù)治療提供幫助。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種為實(shí)現(xiàn)有效且方便地檢測(cè)血液中g(shù)alectin-Ι而 專門設(shè)計(jì)的檢測(cè)試劑，其應(yīng)用于檢測(cè)血液中g(shù)alectin-Ι，具有較高的靈敏度和特異性。
[0007] 為達(dá)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)待測(cè)樣品中半乳凝集 素-1 (galectin-Ι)的方法，該方法主要是包括以乳糖修飾的金納米棒（Lac-GNRs)為探針， 以紫外-可見光-近紅外分光光度計(jì)為檢測(cè)手段，從而對(duì)gelactin-Ι進(jìn)行高效且特異的檢 測(cè)。
[0008] 具體而言，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)待測(cè)樣品中半乳凝集素-1的方法，該方法包 括：
[0009] 以乳糖修飾的金納米棒為探針，使其與待測(cè)樣品接觸混合，維持體系溫度20~ 37°C靜置10分鐘到2小時(shí)，通過檢測(cè)混合體系的顏色來檢測(cè)半乳凝集素-1。
[0010] 本發(fā)明的方法可在分子水平或是細(xì)胞水平或是直接對(duì)人體血液中的galectin-1 進(jìn)行準(zhǔn)確的檢出，由于galectin-1與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此本發(fā)明的方法有可能成為 癌癥轉(zhuǎn)移早期監(jiān)測(cè)的一種新型手段。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測(cè)待測(cè)樣品中半乳凝集 素-1 (galectin-Ι)的方法中，所述的待測(cè)樣品可以是galectin-Ι的水溶液、癌細(xì)胞培養(yǎng)液 或是待測(cè)個(gè)體的血液或血清等，本發(fā)明的方法具有較高的檢測(cè)靈敏度和特異性。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測(cè)待測(cè)樣品中半乳凝集 素-1 (galectin-Ι)的方法在具體實(shí)施時(shí)，可先將待測(cè)樣品（例如galectin-Ι的水溶 液、癌細(xì)胞培養(yǎng)基或人體血清等）加入到所乳糖修飾的金納米棒（Lac-GNRs)水溶液 中，搖勻后靜置10分鐘到2小時(shí)，使用紫外-可見光-近紅外分光光度計(jì)（UV-Vis-NIS spectrophotometer)對(duì)體系進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)，通過吸收曲線的變化判斷待檢物中是否含有 galectin-Ι，或者也可以肉眼觀察體系顏色變化以檢測(cè)待檢樣品中的半乳凝集素-1。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測(cè)待測(cè)樣品中半乳凝集素-1的方法中， 所述乳糖修飾的金納米棒水溶液中，乳糖修飾的金納米棒濃度為1〇ηΜ到ΙΟΟηΜ。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測(cè)待測(cè)樣品中半乳凝集素-1的方法中， 所述待測(cè)樣品與乳糖修飾的金納米棒水溶液的體積比為1 :1~100。
[0015] 本發(fā)明的檢測(cè)待測(cè)樣品中半乳凝集素-1的方法，靈敏度高，待測(cè)樣品中 Galectin-Ι的濃度低至ΙρΜ也可以檢測(cè)出。
[0016] 另一方面，本發(fā)明還設(shè)計(jì)了一種為實(shí)現(xiàn)有效且方便地檢測(cè)血液中g(shù)alectin-Ι而 專門設(shè)計(jì)的檢測(cè)試劑，其主要包括乳糖修飾的金納米棒（Lac-GNRs)。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí) 施方案，所述乳糖修飾的金納米棒為含疏基的乳糖通過金-硫鍵與金納米棒連接形成的復(fù) 合物。
[0017] 金納米棒由于其獨(dú)特的表面等離子共振效應(yīng)，在微量物質(zhì)檢測(cè)中是一個(gè)非常重要 的工具。表面等離子共振效應(yīng)使之能吸收其共振頻率上的入射光，造成該頻率上光能量的 損失，方便地被光學(xué)檢測(cè)器檢出。這種表面等離子共振對(duì)金的表面環(huán)境極為敏感，金表面的 微觀變化，包括表面修飾、外界因素造成的團(tuán)聚或者解團(tuán)聚都能對(duì)光學(xué)吸收造成很明顯地 變化（Cao,J.，Sun,T.，Grattan,Κ·Τ·V.GoldNanorod-BasedLocalizedSurfacePlasmon ResonanceBiosensors:AReview,SensorsandActuatorsB, 2014, 195,332 - 351)〇 同 時(shí)金納米棒具有特殊的空間各向異性，其棒狀形態(tài)使之具有橫向和縱向兩個(gè)方向的表面等 離子共振峰，使之對(duì)痕量物質(zhì)的響應(yīng)特別敏感（Huang,H.W.Qu,C.T.，Liu,X.Y.，Huang,S. ff. ,Xu,Z,J. ,Zhu,Y.J. ,Chu,P.K.,AmplificationofLocalizedSurfacePlasmon ResonanceSignalsbyaGoldNanorodAssemblyandUltra-SensitiveDetectionof Mercury,Chem.Commun.，2011，47, 6897-6899)。正是由于這些特性，金納米棒有可能成為 g