人胰島素及類似物或偶聯(lián)物體外生物活性測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于人胰島素及類似物或偶聯(lián)物體外生物效價測定檢測技術(shù)領(lǐng)域，包括 速效胰島素如門冬胰島素 （Insulin aspart)、賴脯胰島素 （Insulin Lispro)、賴谷胰島素（ Insulin Glulisine),長效胰島素如甘精胰島素 （Insulin glargine)、地特胰島素 （Insulin Detemir)、德谷胰島素 （Insulin Degludec)以及修飾偶聯(lián)物如聚乙二醇化胰島素(如 PEG-Lispro, PEG-Insulin)和 PEG-Insulin (PEG conjugated des B30_insulin)的體外生 物效價測定方法及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰島素是由胰島β細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素， 胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素。胰島素主要促進肝細胞、肌細胞、脂肪細胞對葡萄糖 的攝取和利用，促進肌肉、脂肪組織等靶細胞的細胞膜載體將血液中的葡萄糖轉(zhuǎn)運入細胞， 轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅嶙鳛樘窃A存，同時加速氧化葡萄糖為高能磷酸化合物作為能量的來源，從 而使血糖水平下降，同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。胰島素作為糖尿病治療的主要藥物， 可有效調(diào)節(jié)人體血糖水平。
[0003] 胰島素制劑根據(jù)胰島素作用起效的快慢、持續(xù)時間的長短，可以分為三大種類： (1)速效人胰島素類似物：包括門冬胰島素、賴脯胰島素和賴谷胰島素；（2)中效胰島素：包 括普通胰島素、中性胰島素；（3)長效人胰島素：包括甘精胰島素、地特胰島素和德谷胰島 素。為了適應不同糖尿病人的治療需要，其中有的短中長效制劑或加入輔助治療制劑(魚精 蛋白、鋅離子）或進行不同比例的預混型胰島素提高其治療效果。 人胰島素及類似物或偶聯(lián)物注射液能實現(xiàn)不同時間內(nèi)的有效控制血糖的水平，如制品 中效價測定不準確，會產(chǎn)生低血糖反應癥狀，人胰島素及類似物或偶聯(lián)物藥物治療研究過 程中生物效價準確性尤為重要。目前國際上針對人胰島素及類似物或偶聯(lián)的生物效價測定 是動物體內(nèi)法，主要包括小鼠和家兔的體內(nèi)血糖濃度變化的生物效價分析方法，如中國藥 典的雙交叉小鼠法和美國藥典的家兔降血糖法。胰島素的生物效價目標單位定義法為：家 兔注射最小質(zhì)量人胰島素，血糖值達到2. 5mmol/L為1單位效價。各種短中長效人胰島素及 制劑的生物效價均采用此定義法表示，測定時用胰島素效價標準品進行交叉比對計算而得 效價，常規(guī)制劑中每ml注射液按100單位標示，而非質(zhì)量來標示，在胰島素原料和制劑中， 由于尚無有效可靠的體外細胞法來分析檢測生物效價的方法，常用已知1單位效價的質(zhì)量 反應生物效價。如普通胰島素的1單位效價相當于0. 〇3846mg，地特胰島素的1單位效價 相當于0. 142mg，由于胰島素屬于生物制品，特別在制劑中可能出現(xiàn)因物理、化學等影響穩(wěn) 定性的因素，造成生物效價的改變，如單獨用質(zhì)量換算而成的生物效價會出現(xiàn)明顯誤差，因 此，人胰島素及制劑需要建立一種體外準確生物活性或效價的分析測定方法。
[0004] 國內(nèi)外文獻報道人胰島素體外效價測定方法有大鼠原代成熟脂肪細胞法和 3T3-L1前脂細胞誘導脂肪細胞法。大鼠原代提取的成熟脂肪細胞法是利用3H標記的葡萄 糖來檢測成熟脂肪細胞葡萄糖利用率，測定胞內(nèi)同位素分析生物效價。由于原代成熟脂肪 細胞極容易破碎、無法有效計數(shù)和重復性差，該方法只有諾和諾德公司用于地特胰島素質(zhì) 量研究文獻中有過報道。3T3-L1前脂細胞誘導脂肪細胞法由于誘導率低、誘導過程中容易 發(fā)生細胞脫落、孔間誘導成功的脂肪細胞不均勻等原因僅停留于胰島素論文研究中。本專 利創(chuàng)新性地建立了一種穩(wěn)定、敏感和可重現(xiàn)的原代前脂肪細胞誘導分化成脂肪細胞后采用 非同位素標記的葡萄糖利用率的變化與一定濃度范圍梯度的人胰島素及類似物或偶聯(lián)物 間的線性關(guān)系，可準確計算并評價人胰島素制品的體外生物活性效價。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及人胰島素制品的生物效價測定方法技術(shù)，提供了一種實用、準確性高、 重現(xiàn)性好的人胰島素制品的體外生物效價測定方法及應用。
[0007] 解決本發(fā)明技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是人胰島素及類似物或偶聯(lián)物體外生物 效價測定方法，包括如下步驟： (a)提取雄性大鼠腹部溝、附睪、腎周圍脂肪墊的脂肪細胞，分離前脂肪細胞。
[0008] (b)用DMEM完全培養(yǎng)液含終濃度為0. 2~lmmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、 0. 5~2 μ mol/L地塞米松和2~10 μ g/mL人胰島素的誘導劑I誘導前脂肪細胞48~72 小時。
[0009] 再用DMEM完全培養(yǎng)液中含終濃度為2~10 μ g/mL人胰島素的誘導分化劑II誘導 分化培養(yǎng)48~72小時。
[0010] (c)誘導分化成脂肪細胞后，經(jīng)饑餓培養(yǎng)24小時，加入不同濃度梯度的人胰島素 樣品，37°C 5%C02反應6-12小時。
[0011] (d)直接取培養(yǎng)上清5~20 μ 1加入含微量葡萄糖氧化酶的反應體系中，37°C反 應10分鐘，用490~540nm測定吸光值來獲及葡萄糖消耗利用率。
[0012] (e)根據(jù)不同濃度人胰島素待測樣品的培養(yǎng)液中葡萄糖消耗利用率與平行測定中 的人胰島素效價標準品進行計算，獲及待測人胰島素及類似物或偶聯(lián)物的生物效價單位。
[0013] 本發(fā)明是根據(jù)人胰島素及類似物或偶聯(lián)物刺激脂肪細胞轉(zhuǎn)運葡萄糖的原理，經(jīng)建 立的方法研究證明，人胰島素在一定濃度梯度范圍內(nèi)和葡萄糖消耗利用率間呈良好的劑量 線性關(guān)系。利用葡萄糖氧化酶代替3H標記葡萄糖測定胞內(nèi)葡萄糖的分解變化，測定誘導分 化脂肪細胞的細胞培養(yǎng)液葡萄糖含量變化，可準確敏感計算出人胰島素及類似物或偶聯(lián)物 生物效價。葡萄糖氧化酶法其原理為：葡萄糖氧化酶利用氧和水將葡萄糖氧化為葡萄糖酸， 并釋放過氧化氫；過氧化物酶在色原性氧受體存在時將過氧化氫分解為水和氧，并使色原 性氧受體4-氨基安替比林和酚去氫縮合為紅色醌類化合物，即Trinder反應。紅色醌類化 合物的生成量與葡萄糖含量成正比。本發(fā)明利用其原理可準確地測定細胞培養(yǎng)液中的葡萄 糖消耗變化。本發(fā)明已具有生物制品體外生物效價測定方法的操作步驟簡便、無污染、低成 本、準確性高、重復性好等要求。
[0014]
【附圖說明】
[0015] 圖I 3T3-L1前脂肪細胞和大鼠前脂肪細胞的GOD-POD法測定重組人胰島素體外 生物活性 圖2大鼠原代成熟脂肪細胞3H-gluc〇se放射法測定重組人胰島素體外生物活性 圖3葡萄糖氧化酶法測定重組人胰島素和地特胰島素的體外生物活性 圖4 3H-Gluc〇se放射測定法測定重組人胰島素和地特胰島素體外生物活性 圖5重組人胰島素、門冬胰島素、賴脯胰島素、甘精胰島素、地特胰島素和PEG及修飾偶 聯(lián)物（PEG-Lispro)體外活性測定
【具體實施方式】
[0016] 以下是本發(fā)明的非限定實施例，將有利于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進一步理解本發(fā) 明。
[0017] 實施例1重組人普通胰島素體外生物效價測定的三種測定方法比較 采用3T3-L1前脂肪細胞(購自中國科學院上海細胞庫)和雄性大鼠前脂肪細胞(購自雄 性大鼠購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院動物所）測定重組人胰島素活性的方法，重組人普通胰 島素標準品(來源于中國食品藥品檢定研究院，每支標示含量為20mg/支28. 3IU/mg)。
[0018] 大鼠前脂肪細胞GOD-POD法 (1)取普通食物喂養(yǎng)的90g~120g的雄性大鼠，乙醚麻醉后斷頭處死，放入75%酒精浸 泡完全消毒，無菌條件下切取腹部溝、附睪、腎周圍脂肪墊放入培養(yǎng)皿的PBS中，用手術(shù)剪 刀盡量除去血管及淋巴結(jié)，然后用PBS液沖洗3次。充分剪碎所取脂肪組織成lmm3，加入濃 度為0. 5mg/ml I型膠原酶消化液，37°C水浴中振蕩消化1小時。取DMEM完全培養(yǎng)液20ml 加入組織塊中，用吸管反復吹打。然后100目網(wǎng)篩過濾，1200g離心10min。離心后將上層 含成熟脂肪細胞的脂肪層取入新離心管中備用，再棄掉消化液，加入DMEM完全培養(yǎng)液重懸 沉淀細胞，重復操作二次后，取含前脂肪細胞的細胞沉淀經(jīng)細胞計數(shù)后，以2. 5~3. 5 X 105 個/ml加入48孔細胞板20〇μ1/孔，置37°C，5% C02培養(yǎng)24小時。待細胞匯合率達到90% 以上后開始誘導。
[0019] (2)棄培養(yǎng)上清，加入用DMEM完全培養(yǎng)基配制終濃度為0. 5mmol/L 3-異丁 基-1-甲基黃嘌呤、Ιμπιο?/L地塞米松和lOyg/mL胰島素的誘導溶液I 20〇μ1/孔，置 37°C，5%C02培養(yǎng)48~72小時。
[0020] (3)棄細胞液，加入用DMEM完全培養(yǎng)液配制終濃度為10 μ g/mL胰島素的誘導劑 II 20〇μ1/ 孔，置 37°C，5%C02 培養(yǎng) 48 ~72 小時。
[0021] (4)棄細胞液，加入DMEM完全培養(yǎng)基20〇μ1/孔，置37°C，5%C02培養(yǎng)48小時。
[0022] (5)棄細胞液，加入含1%FBS的DMEM細胞饑餓液20〇μ1/孔，置37°C，5%C02培養(yǎng) 24小時。
[0023] (6)重組人普通胰島素的配制：用含1.0 mg/ml葡萄糖的DMEM稀釋液逐步稀釋至 5ug/ml后，再按3倍倍比稀釋，共8個稀釋度。
[0024] (7)棄細胞培養(yǎng)液，加入1.0 mg/ml葡萄糖的DMEM的細胞維持液18〇μ1/孔，再加入 配制的胰島素樣品20 μL/孔37°C 5%C02反應10小時。
[0025] (8)取培養(yǎng)上清20 μ 1加入酶標反應板中，再加入葡萄糖氧化酶200 μ 1/孔，置 37°C反應10分鐘后。用酶標儀5IOnm測定OD值。
[0026] 大鼠成熟脂肪細胞3H_glucose放射法 (I) I