通過直接maldi/ms檢測干液斑中化合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及存在于生物體液中至少一種化合物的檢測方法，尤其涉及存在于干液 斑中至少一種化合物的檢測和/或鑒定方法。本發(fā)明還涉及一種用于分析干液斑中化合物 空間分布的方法。本申請描述了用于干液斑分析的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 液體分析目前主要在液態(tài)樣本上進行。這樣的液態(tài)樣本不便于運輸，而且分子化 合物的完整性不能長期保持。為了便于運輸和更長時間的保存，液體可以在合適的載體上 進行干燥。例如，干血紙片法（或DBS)是最小血液取樣技術(shù)，其包括滴加至少一個小血滴到 紙載體上。通常，該紙載體被特別設(shè)計為能夠吸收小血滴以用于進一步分析。在送入分析 實驗室之前，血斑允許在室溫下風(fēng)干幾個小時。少量的血液樣本和試樣的易于處理造就了 DBS取樣技術(shù)的成功。此外，它允許簡化存儲和廉價運輸。它的成功始于20世紀60年代， 那時羅伯特?蓋斯瑞（RobertGuthrie)博士開發(fā)出來了用于苯丙酮尿癥檢測的化驗。從 那以后，"Guthrie卡"已在新生嬰兒篩查中被全世界采用。利用纖維素載體血液取樣（用 少量血液的微創(chuàng)技術(shù)）的優(yōu)點是特別適合于兒科患者，但對于臨床前及臨床研究（3R原則： 減少，替代和優(yōu)化）同樣有吸引力。目前，干斑取樣技術(shù)的使用被推廣到其他生物體液，如 血清，血漿或尿液。
[0003] 例如，新生兒篩查和藥理活性都采用質(zhì)譜（或MS)技術(shù)用于干血斑分析。直到 最近，在液體介質(zhì)中萃取和分離的幾個步驟仍然是必要的；導(dǎo)致在MS分析可進行之前有 一個較長時間的樣本制備。取自干血斑樣本的少許（分析物）的液體萃取通常使用水溶 劑或有機溶劑的混合物進行，接著是液相色譜（LC)分離。由于液體萃取的步驟和/或分 離的步驟存在，樣本被污染和/或存在于樣本中的化合物被破壞可能在這些步驟當中的 一個步驟中發(fā)生。為了規(guī)避這些樣本制備和操作的問題，而這在診斷和制藥領(lǐng)域中極為 重要，新的、直接的技術(shù)發(fā)展起來了（綜述見D6glonetal.，2012[AnalBioanalChem 2012,402:2485-2498])。技術(shù)的發(fā)展主要集中在通過直接洗脫（例如在線液體萃?。┗?直接解吸/電離進行DBS快速分析。后一方法是最快的解決方案（無需預(yù)處理），特別適 合于高通量的干液斑分析。在這樣的背景下，提出了一些從不同的基本電離技術(shù)發(fā)展而來 的敞開式MS方法：解吸電噴霧電離（DESI)和電噴霧電離（ESI)中的紙噴霧電離（PSI)，氣 體放電電離（GDI)中的實時直接分析（DART)和電子電離（EI)中的常壓熱解吸化學(xué)電離 (APTDCI)〇
[0004] 這些MS方法用來分析不同的干液斑，但出現(xiàn)了主要的限制。例如，干血斑中的 分析物分布可能受到幾種因素的影響，如血斑大小、紅細胞壓積水平和擴散性質(zhì)（色層效 應(yīng)）。通過直接解吸/電離的分析物化驗，可能會被這些因素所影響。分析物分布成像是指 導(dǎo)這些分析物化驗的有效方法。然而，干血斑中的分析物分布成像（在上述MS方法中）已 經(jīng)完成。放射自顯影的靈敏度和分辨率都還不足以進行可靠的分析。因此，由于成像方法 的低靈敏度和/或低分辨率，分析干液斑樣本的直接解吸/電離方法會受到限制，從而導(dǎo)致 分析物檢測不夠精確。樣品制備和隨后的分析仍然是基本問題，其限制了這些方法在干液 斑分析領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0005] 因此，需要一種簡單、快速且可靠但無需預(yù)處理的方法來檢測存在于干液斑中的 化合物。此外，還需要一種不使用特定標簽，允許存在于干液斑中化合物成像，同時具有高 靈敏度和高質(zhì)量分辨率，而對生物污染物不太敏感的MS方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 因此在這個背景下，本發(fā)明的目的是通過提供一種檢測存在于液體樣本中至少一 種化合物的方法，至少部分地解決目前現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，優(yōu)選地，該方法沒有液體萃 取步驟，最終通過印跡步驟，其可以保持存在于干液斑中化合物的空間分布，并允許通過分 子成像工具進一步測定它們的空間分布。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種檢測存在于生物體液中至少一種化合物的方 法，所述方法包括以下步驟：
[0008] 步驟a，在載體上提供至少一個干液斑；
[0009] 步驟b，固定在所述載體上的所述干液斑的至少一部分到導(dǎo)電表面上；
[0010]步驟c，提供紫外光吸收化合物的水溶液或有機溶液；
[0011] 步驟d，將所述紫外光吸收化合物沉積到固定在所述導(dǎo)電表面上的所述載體上干 液斑的至少一部分上；
[0012] 步驟e，使載體上所述干液斑的至少一個區(qū)域經(jīng)受基質(zhì)輔助激光解吸/電離過程 以產(chǎn)生離子；
[0013] 步驟f，用質(zhì)譜儀分析儀獲取所述離子的全掃描模式質(zhì)譜，和
[0014] 步驟g，通過分析所述全掃描模式質(zhì)譜確定至少一種化合物的存在。
[0015] 該方法允許存在于干液斑中至少一種化合物快速且可靠的檢測和可視化，而不需 要在通過MS分析之前的任何預(yù)處理步驟。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過MALDI質(zhì)譜，載體上干液 斑的直接分析克服了現(xiàn)有技術(shù)的局限性。本發(fā)明申請人發(fā)現(xiàn)可以簡單且快速地分析存在于 液體樣本中的化合物，而不需要任何液體萃取和分離步驟，這是有利的，因為樣品能夠制備 得更快以及沒有存在于干液斑中化合物的液體萃取步驟，避免了化合物潛在的污染和/或 降解。換句話說，本發(fā)明的方法不包括存在于干液斑中化合物的任何液體萃取和分離步驟。 至少一滴液體沉積在載體上后，載體上的干液斑至少一部分被固定在導(dǎo)電表面上，沒有任 何干液斑的消解或液體萃取步驟。
[0016] 在另一實施例中，本發(fā)明涉及用于檢測液體中至少一種化合物的方法，其中執(zhí)行 了轉(zhuǎn)移存在于干液斑中至少一種化合物到膜的進一步步驟。因此，在提供至少一個干液斑 到載體上后，所述方法包括以下步驟：
[0017] ?轉(zhuǎn)移來自于干液斑的至少一種化合物到膜上，
[0018] ?固定所述膜的至少一部分到導(dǎo)電表面上。
[0019] 由于原始紙載體的厚度問題，通過MALDI質(zhì)譜的干液斑直接分析可能承受某些應(yīng) 用和/或化合物的挑戰(zhàn)。所提出的間接方法可以通過轉(zhuǎn)移至少一種化合物到較薄的載體上 解決這個問題，如纖維素或聚偏氟乙烯（PVDF)膜。此實施例可以克服厚度問題，而干液斑 上待分析的化合物的空間定位被保存在膜上。
[0020] 在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明涉及一種用于進一步測定干液斑內(nèi)化合物空間分布 的方法，該方法包括進一步的步驟：
[0021] ?獲得存在于干液斑內(nèi)在至少2個區(qū)域離子的完整掃描模式質(zhì)譜，相對于第二區(qū) 域，第一區(qū)域更靠近所述干液斑的中心，
[0022] ?對應(yīng)于在所述干液斑區(qū)域內(nèi)待檢測的至少一種化合物計算出的質(zhì)量電荷比，選 擇精確質(zhì)量電荷比（m/z)，
[0023] ?確定干液斑內(nèi)所述化合物的空間分布。
[0024] 這種優(yōu)選的實施例允許化合物的存在與其在干液斑內(nèi)的空間分布相關(guān)聯(lián)。這是有 利的，因為存在于干燥液斑中心和外圍區(qū)域化合物的位置的顯著差異可能會影響質(zhì)譜（MS) 化驗結(jié)果。化合物分布研究有助于指導(dǎo)和優(yōu)化局部解吸/電離質(zhì)譜的發(fā)展。此外，這種優(yōu) 選的實施例允許干液斑中所選擇的化合物的性質(zhì)、濃度和空間位置相關(guān)聯(lián)。
[0025] 優(yōu)選地，使用根據(jù)本發(fā)明所述方法待分析的化合物是在液體中的化合物，其計算 出的質(zhì)量電荷比在1〇〇到1500m/z之間。
[0026] 事實上，當化合物質(zhì)量電荷比在100到1500m/z之間時，根據(jù)本發(fā)明所述的方法特 別有效。利用本發(fā)明所述的方法，基于測量的精確質(zhì)量電荷比，這些化合物可以容易且快速 地在液體樣本中被鑒定。
[0027] 本發(fā)明被獨立權(quán)利要求所限定。從屬權(quán)利要求限定有利的實施例。
【附圖說明】
[0028] 下面通過參考附圖以舉例的方式更詳細地解釋本發(fā)明的上述和其他方面。附圖 中：
[0029] 圖1示出根據(jù)本發(fā)明的一個方面在干血斑上進行直接MALDI質(zhì)譜實驗的示意圖。
[0030] 圖2示出干血斑脂的MALDIFT-ICR質(zhì)譜：（a) 57. 75-1500m/z區(qū)域的平均質(zhì)譜； (b) 350-550m/z區(qū)域的放大視圖；（c)550-750m/z區(qū)域的放大視圖；（d)750-950m/z區(qū)域的 放大視圖。質(zhì)譜注釋（1-35)對應(yīng)于表1中的脂質(zhì)分布。
[0031] 圖3示出干血斑中兩種小藥物化合物的MALDIFT-ICR質(zhì)譜：(a)示出右美沙芬 (500,100和20picomol/L) [M+H]+離子在248 - 287m/z區(qū)域的平均質(zhì)譜；(b)示出胺碘酮 (500 和 100picomol/L) [M+H]+離子在 628 - 656m/z區(qū)域的平均質(zhì)譜。
[0032] 圖4示出在纖維素載體上的干血斑，轉(zhuǎn)移了的PVDF膜和通過在膜上執(zhí)行本發(fā)明所 述方法的質(zhì)譜：(a)干血斑的光學(xué)圖像；(b)用氨基黑IOB染色的轉(zhuǎn)移了的膜的光學(xué)圖像； (c) 200 - 1400m/z區(qū)