一種檢測腫瘤標志物的三維石墨烯修飾電極及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物電化學檢測技術領域，具體涉及一種檢測腫瘤標志物的三維石墨 稀修飾電極及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 腫瘤相關標志物的分析檢測對疾病的有效診斷與治療具有十分重要的意義。因 此，如何快速、高效、靈敏地檢測這些標志物，就成為了當前生命科學領域中所面臨的一個 十分重要的問題。顯然，解決這個問題的關鍵就在于發(fā)展各種新型的分析檢測技術。生物 傳感器的出現(xiàn)為有效地解決這些問題提供了新的工具，為生命科學及其相關領域的研究提 供了許多新的方法。
[0003] 生物傳感器是由固定化的生物敏感材料（包括酶、抗體、核酸等生物活性物質）作 識別元件，對生物物質敏感并將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器。電化學生物傳感器 是指在生物傳感器的基礎上，以電極作為轉換元件，以電勢或電流為特征檢測信號的傳感 器。因其具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低的特點，使其在近幾十年獲得蓬勃而 迅速的發(fā)展。
[0004] 電化學生物傳感器中所用電極對檢測的靈敏度有著至關重要的作用?；谌S石 墨烯的獨特性能（如多孔性、表面積大、突出的電子傳導性能及傳質快），采用氮摻雜三維 石墨烯修飾金電極，用于生物傳感器，在一定程度上提高了該生物傳感器的檢測性能。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明提供了一種檢測腫瘤標志物的三維石墨烯修飾電極的 制備方法，該制備方法簡單，制備條件易于控制和實現(xiàn)。
[0006] 本發(fā)明還提供了 一種三維石墨烯修飾電極。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種該三維石墨烯修飾電極用于檢測腫瘤標志物的應用。
[0008] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0009] -種檢測腫瘤標志物的三維石墨烯修飾電極的制備方法，包括以下步驟：
[0010] (1)將金電極預處理；
[0011] (2)將預處理后的金電極浸沒在0. 5mM的4-氨基對苯硫酚的乙醇溶液中，靜置反 應1~3h ;
[0012] (3)將氧化石墨烯溶于水中，得氧化石墨烯溶液，超聲分散均勻后，加入氨水；其 中，所用氨水的質量濃度為25 %~28% ;
[0013] (4)將步驟（2)中電極取出，用乙醇溶液沖洗干凈，浸沒到步驟（3)所得溶液和 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)的混合溶液中，室 溫條件下，反應6~8h ;然后，將以上反應體系放入到反應釜中，在140~180°C的條件下， 反應6~8h ;待反應結束后，將電極取出，用蒸餾水將電極洗滌干凈后將其冷凍干燥，即得 三維石墨稀修飾電極。
[0014] 步驟⑴中，金電極預處理過程：先后用0· 5 μπι和(λ 03 μπι的Al2O3粉末打磨 成鏡面，然后用二次水清洗，再依次置于乙醇和二次水中超聲1~2min;處理完成后， 用0. 5mol · L 1的濃硫酸對電極進行活化，直到產(chǎn)生穩(wěn)定的循環(huán)伏安掃描圖，掃描電壓為 0. 20~I. 65V，掃速為0.1 V · s %最后用二次水沖洗，室溫干燥。
[0015] 步驟（3)中，氧化石墨烯的制備方法：在冰水浴條件下，將0. 6g石墨、1.0 g硝酸鈉 混合，攪拌條件下，緩慢加入35mL冷凍濃硫酸，攪拌0. 5~1小時；在0. 5~1小時內加入 3. Og高錳酸鉀，在0~10°C下攪拌2h ;將體系溫度升高至35°C，攪拌30min，逐滴加入150mL 去離子水；然后將體系溫度升高到98°C，攪拌15min ;預熱200mL去離子水至60°C，將反應 完畢的體系邊攪拌邊轉移到去離子水中；向體系中逐滴加入雙氧水，直至體系顏色變?yōu)楹?色；用5%鹽酸抽濾清洗三次，取1~3mL濾液加入到氯化鋇溶液中，若無沉淀生成則清洗 干凈；用離心機離心清洗，至上清液pH為2~5,將氧化石墨烯轉移至蒸發(fā)皿中，用保鮮膜 密封，放在冰箱中冷凍2~5h，再冷凍干燥，即得。
[0016] 步驟（3)中，氧化石墨稀溶液的濃度為1~3mg · mL 1C3
[0017] 步驟（3)中，氧化石墨烯溶液與氨水的體積比為600:1~600:5。
[0018] 步驟⑷中，EDC與NHS的濃度分別為0. 1~0. 3M。
[0019] 步驟（4)中，EDC、NHS和氧化石墨稀的體積比為1: 1:1~2:1: 1。
[0020] 上述三維石墨烯修飾電極在檢測腫瘤標志物中的應用，檢測步驟為：
[0021] (1)將羧基化的磁珠用pH為7. 0的咪唑-鹽酸緩沖溶液洗滌，重復三次后，加入 EDC、NHS，在30~40°C的條件下，反應30~60min，將反應后的體系用磷酸緩沖溶液（PBS) 洗滌3~6次，最后將所得物分散于磷酸緩沖溶液溶液中；
[0022] (2)將氨基化的捕獲DNA(SO)加入到步驟⑴所得到的溶液中，在室溫條件下，反 應2~3h，得到帶有捕獲DNA的磁珠，將所得磁珠保存在0~KTC的條件下；
[0023] (3)將與捕獲DNA互補度為1/3~1/2的富含鳥嘌呤脫氧核苷酸的DNA鏈（SI)，加 入到步驟（2)所獲得的磁珠溶液中，在室溫條件下，反應1~2h，加入氯高鐵血紅素 hemin， 使得富G部分形成G-四聯(lián)體，最終制得hemin/G-四聯(lián)體/SO/磁珠的結構；
[0024] (4)將hemin/G-四聯(lián)體/SO/磁珠加入到與捕獲DNA完全互補或特異性識別的靶 物質的溶液中，室溫條件下，反應1~2h ;
[0025] (5)將步驟（4)反應后的溶液混合均勻，滴涂在三維石墨烯修飾電極表面，干燥 后，測其電化學響應信號。
[0026] 所述靶物質為凝血酶或TP53。
[0027] 步驟⑴中，EDC與NHS的濃度分別為0· 6~1M、0. 1~0· 3M。
[0028] 步驟（1)中，EDC與NHS的體積比為1:1~2:1。
[0029] 步驟（2)中，SO的濃度為20~30ηΜ。
[0030] 步驟（3)中，SI的濃度為20~30ηΜ。
[0031] 本發(fā)明的有益效果是：
[0032] (1)發(fā)明巧妙的利用氮摻雜三維石墨烯修飾的金電極檢測反應體系中被靶DNA 鏈擠脫掉的hemin/G-四聯(lián)體結構，間接的反映出靶物質的濃度；當靶物質濃度較高時，則 hemin/G-四聯(lián)體/SO/磁珠結構中被擠脫掉的hemin/G-四聯(lián)體數(shù)量就比較多，則滴涂到金 電極表面的溶液中的hemin/G-四聯(lián)體的濃度也相應的比較大，從而在電化學檢測的過程 中產(chǎn)生較大的電化學信號，靶物質和電化學信號之間存在正比例關系。
[0033] (2)在本發(fā)明中三維石墨烯與金電極之間是通過4-氨基對苯硫酚的橋梁作用來 連接的，金電極與4-氨基對苯硫酚之間是通過Au-S的作用連接的，EDC、NHS用來活化氧化 石墨烯結構中的-C00H，以便使氧化石墨烯通過與4-氨基對苯硫酚中_順 2的酰胺縮合反應 連接到金電極表面，所以結構很牢固。
[0034] (3)本發(fā)明以氨水作為氮摻雜三維石墨烯的氮源，以氧化石墨烯作為三維石墨烯 的原料，三維石墨烯具有多孔性、表面積大、突出的電子傳導性能及傳質快等優(yōu)點，本發(fā)明 中使用氮摻雜三維石墨烯是因為一方面氮原子能誘導更多的正電荷到相鄰的碳原子上；另 一方面N原子由于具有與C原子近似的原子半徑，可以作為電子供體以取代的方式對石墨 烯進行摻雜，摻雜的N原子會影響C原子的自旋密度和電荷分布，使生成的氮摻雜石墨烯表 現(xiàn)出較純石墨烯更多優(yōu)異的性能。
【附圖說明】
[0035] 圖1為本發(fā)明制備三維石墨烯修飾電極的過程示意圖；
[0036] 圖2為本發(fā)明的三維石墨烯修飾電極用于靶物質的檢測原理圖。
【具體實施方式】
[0037] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0038] 實施例1 :
[0039] -種檢測腫瘤標志物的三維