一種pd-1抗體檢測試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗體檢測試劑盒，特別是涉及一種ro-i抗體檢測試劑盒及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在正常情況下，機(jī)體免疫反應(yīng)激活產(chǎn)生的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)可以 殺死體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。腫瘤的免疫抑制作用是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷的重要機(jī) 制。腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域的最新研宄發(fā)現(xiàn)，程序性死亡分子-l(PD-l)介導(dǎo)的免疫抑制反應(yīng)是 CTL發(fā)生凋亡、無力以及功能耗竭的重要原因。腫瘤細(xì)胞及其腫瘤相關(guān)的免疫抑制性細(xì)胞 表面表達(dá)B7-H1/4分子，它們是已知的H)-l配體，當(dāng)CTL進(jìn)入腫瘤微環(huán)境時，CTL細(xì)胞表面 的H)-l會被其配體激活，引發(fā)胞內(nèi)的SHP1/2的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或功能耗竭，從 而無法有效殺傷腫瘤細(xì)胞。
[0003] 目前，通路阻斷劑抗ro-1和B7-H1/4單克隆抗體的相關(guān)研宄具有突破性的進(jìn)展， 研宄發(fā)現(xiàn)其能阻斷ro-i對t細(xì)胞的抑制作用，從而激活腫瘤患者體內(nèi)的免疫細(xì)胞殺瘤效 應(yīng)，減少抑制性調(diào)節(jié)T細(xì)胞效應(yīng)，以增強(qiáng)CTL殺傷癌細(xì)胞的功能，其已成為近年來免疫治療 的熱點(diǎn)。多項(xiàng)荷瘤動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阻斷ro-i通路可以增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)、延長生存期、改 善預(yù)后。針對ro-i通路阻斷的單克隆抗體用于進(jìn)展期惡性黑色素瘤的三期臨床試驗(yàn)已經(jīng) 完成，其抗腫瘤效果顯著，已被美國FDA批準(zhǔn)為可上市藥物。由于ro-i抗體的廣譜抗癌作 用，其對腎癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、白血病、頭頸癌、腸癌和腦瘤等癌癥的臨床療效研宄也 正在二期或三期臨床試驗(yàn)之中。
[0004] ro-1抗體作為一種新型、安全、高效的抗腫瘤藥物，勢必將在臨床腫瘤治療中被大 量應(yīng)用，科研領(lǐng)域也會對該藥物的劑型、藥代動力學(xué)等做深入的研宄，因此迫切需要一種針 對ro-i抗體的特異性檢測方法。
[0005] 雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫技術(shù)是目前對蛋白質(zhì)類物質(zhì)進(jìn)行精確定量最為有效的方 法，其原理是將待測蛋白的一種抗體包被至固相載體（例如酶標(biāo)板）上，用于特異性捕獲待 測蛋白，然后采用待測蛋白的另一種標(biāo)記抗體（例如偶聯(lián)HRP的二抗等）進(jìn)行標(biāo)定和檢測。 然而，PD-1抗體本身就是一種IgG抗體，其具有與相同物種來源IgG相同的結(jié)構(gòu)，大部分區(qū) 域（約2/3序列）為恒定區(qū)，同一物種的IgG恒定區(qū)的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)相同，不同物種的 IgG恒定區(qū)根據(jù)進(jìn)化程度不同具有不同程度的同源性；可變區(qū)主要是結(jié)合特異性抗原結(jié)構(gòu) 域，由于難以獲得針對可變區(qū)的抗IgG抗體，因此一般不會采用該區(qū)的表位制備二抗。如果 采用針對恒定區(qū)表位的兩種抗IgG抗體，顯然無法排除待測血清、組織液等樣本中本身含 有的igG的干擾，因此傳統(tǒng)的雙抗體夾心法無法實(shí)現(xiàn)對ro-i抗體的特異性檢測。目前，尚 無有效的精確測量ro-i抗體濃度的方法，尤其如何測定動物或人血清中ro-i抗體的濃度 成為亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種ro-i抗體檢測試劑盒及其應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的雙抗體 夾心法無法實(shí)現(xiàn)對ro-i抗體的特異性檢測等技術(shù)缺陷。
[0007]本發(fā)明提供一種ro-i抗體檢測試劑盒，包括固相載體、抗體捕獲劑和標(biāo)記抗體， 所述抗體捕獲劑為ro-i細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0. 1。
[0008] 在本發(fā)明的ro-i抗體檢測試劑盒中，ro-i細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)域的重組蛋白能夠 特異性捕獲待測樣本中的ro-i抗體，其可以通過普通市售獲得，例如可以采用ACR0 Biosystems公司生產(chǎn)的貨號為TO1-M5228的重組蛋白；標(biāo)記抗體能夠特異性地與ro-l抗 體結(jié)合并且偶聯(lián)有產(chǎn)生檢測信號的物質(zhì)（例如辣根過氧化物酶、鏈霉素等）。
[0009]該試劑盒的工作原理是：將待測樣本加入到預(yù)包被抗體捕獲劑的固相載體后，抗 體捕獲劑特異性捕獲待測樣本中的ro-1抗體，隨后加入的標(biāo)記抗體特異性地與ro-i抗 體結(jié)合，通過對標(biāo)記抗體上偶聯(lián)物質(zhì)產(chǎn)生的檢測信號進(jìn)行檢測，從而能夠得到待測樣本中 ro-i抗體的濃度。
[0010] 可以理解的是，在本發(fā)明的ro-i抗體檢測試劑盒中，固相載體和抗體捕獲劑可以 獨(dú)立進(jìn)行包裝，也可以預(yù)先將抗體捕獲劑預(yù)包被在固相載體上形成預(yù)包被固相載體，從而 對預(yù)包被固相載體進(jìn)行包裝。
[0011] 在本發(fā)明中，所述標(biāo)記抗體可以為辣根過氧化物酶或鏈霉素標(biāo)記的IgG抗體；特 別是，該標(biāo)記抗體與ro-i細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)域的重組蛋白的來源物種相同，在一實(shí)施方式中， ro-i細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)域的重組蛋白來源于小鼠，標(biāo)記抗體可為辣根過氧化物酶（hrp)偶聯(lián)的 山羊抗大鼠IgG抗體。所述固相載體可以采用本領(lǐng)域常規(guī)載體，例如酶標(biāo)板。
[0012] 此外，本發(fā)明的ro-1抗體檢測試劑盒還可以包括參照品，參照品有利于保證檢測 的準(zhǔn)確性，例如可以是ro-i抗體標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照品和陰性對照品中的一種或多種。其中， ro-1抗體標(biāo)準(zhǔn)品可以是美國Bioxcell公司生產(chǎn)的克隆號為RMP1-14的ro-1抗體，其是小 鼠惡性腫瘤模型治療實(shí)驗(yàn)中用于ro-1阻斷最常用的治療抗體，抗腫瘤效果顯著；陽性對照 品可以是陽性血清、陽性組織勻漿液等；陰性對照品可以是陰性血清、陰性組織勻漿液等。
[0013] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的ro-1抗體檢測試劑盒還可以包括測定所需的常規(guī)試劑，例如 可以包括包被緩沖液、洗滌緩沖液、樣品稀釋液、封閉液、顯色液和終止液中的一種或多種。
[0014]在一實(shí)施方式中，包被緩沖液為pH9. 6的碳酸鹽緩沖液，每升溶液中含有Na2C03 1. 59g和NaHC03 2. 93g ;洗滌緩沖液為pH7. 4的磷酸鹽緩沖液，每升溶液中含NaCl 8. 0g， KC1 0? 2g，KH2P04 0? 24g，Na2HP04 ? 12H20 3. 628g，進(jìn)一步可含吐溫-200. 5mL ;封閉液為含 lmg/mL牛血清白蛋白的pH7. 4的上述磷酸鹽緩沖液；終止液為2mol/L的硫酸。
[0015] 本發(fā)明還提供上述任一所述的ro-1抗體檢測試劑盒在PD-1抗體檢測上的應(yīng)用。 具體地，該應(yīng)用可以體現(xiàn)在科研實(shí)驗(yàn)中對ro-i抗體濃度的測定、PD-1抗體臨床應(yīng)用中的藥 物代謝動力學(xué)研宄等。
[0016] 本發(fā)明還提供一種ro-i抗體檢測方法，采用上述的ro-i抗體檢測試劑盒進(jìn)行，所 述ro-i抗體檢測方法包括如下順序進(jìn)行的步驟：
[0017] 1)將所述ro-i細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)域的重組蛋白預(yù)包被在所述固相載體上，制得預(yù)包 被固相載體；
[0018] 2)向所述預(yù)包被固相載體中加入待測樣本，孵育，隨后洗滌；
[0019] 3)向所述預(yù)包被固相載體中加入所述標(biāo)記抗體，孵育，隨后洗滌；
[0020] 4)向所述預(yù)包被固相載體中加入顯色液，孵育，隨后加入終止液，并測定0D45Q。
[0021] 可以理解的是，如所采用的試劑盒中抗體捕獲劑預(yù)包被在固相載體上形成預(yù)包被 固相載體，則檢測方法可省略上述步驟1)。
[0022] 進(jìn)一步地，所述ro-i抗體檢測試劑盒還包括ro-i抗體標(biāo)準(zhǔn)品，所述ro-i抗體檢 測方法還包括：
[0023] 對所述ro-i抗體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，并采用步驟1)至步驟4)測定各梯度稀釋 液的〇d45(i，得到ro-i抗體標(biāo)準(zhǔn)品濃度與od45(i的線性關(guān)系；
[0024] 根據(jù)所測定的待測樣本的〇〇45(|和所述線性關(guān)系，得到所述待測樣本中ro-i抗體 的濃度。
[0025] 進(jìn)一步地，可以采用如下方法制備所述預(yù)包被固相載體：
[0026] 采用包被緩沖液對所述ro-1細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)域的重組蛋白進(jìn)行稀釋，控制稀釋后 的重組蛋白溶液的濃度不低于15. 625ng/mL，將稀釋后的重組蛋白溶液加入到所述固相載 體上進(jìn)行包被；
[0027] 包被結(jié)束后，采用洗滌緩沖液對固相載體進(jìn)行洗滌，隨后向固相載體中加入封閉 液進(jìn)行封閉，封閉結(jié)束后洗滌并干燥，制得所述預(yù)包被固相載體。