一種制備可物理再生蛋白質芯片的方法
【技術領域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種利用陣列化微小毛細空間固定蛋白質溶液和微納磁珠或量子點制備可物理再生蛋白質芯片的方法。
技術背景:
[0002]蛋白質是生命體特有的活性物質，它們既作為結構單元構筑生命體，又作為功能單元執(zhí)行生命活動。許多蛋白質可以與另外一些蛋白質或基因片段等特異性結合，如抗體與抗原的結合、配體與受體的結合、酶與底物的結合等。利用蛋白質之間這種特異性結合可以實現(xiàn)對細菌、病毒等有害物質的檢測，蛋白質芯片就是在此背景下誕生的一種快速高效的檢測手段。蛋白質芯片是生物芯片的一種，它與另一大類基因芯片的最大區(qū)別是需要具備保持蛋白質活性的能力，蛋白質離開水就會失去活性。
[0003]將特定蛋白質固定到芯片基板可以使用共價結合的化學方法，也可以使用非共價結合的物理方法。有報道認為，可以將組氨酸標記的蛋白質固定到鎳氨三乙酸處理過的蓋玻片上(ZhuH,BilginM,Bangham R,et al.Global Analysis ofProtein Activities UsingProteome Chips.Science2001 ；293(5537):2101-05)，但是結合不夠穩(wěn)定，容易受到化學品如鹽類的干擾，而且芯片必須保存在高濕度的密封容器中。也有通過對純化制備蛋白質用的凝膠進行化學修飾處理的辦法，將蛋白質以化學結合方式固定在富含水分的凝膠中，該方法較好地解決了蛋白質活性保持的問題，但是芯片仍為一次性使用，成本較高。
[0004]采用物理方法將蛋白質固定到芯片基板，理論上講具有制作成本低和芯片容易再生復用，但是如何固定牢固并保持蛋白質活性是這種方法需要解決的關鍵問題。單就物理固定方法而言，電場、磁場等技術復雜且芯片不透明，給后續(xù)檢測造成很大困難；直接將蛋白質點入凝膠簡便易行，不足之處是存在蛋白質擴散會使陣點擴大、濃度降低，還可能使陣點相連；在基板上打孔的辦法也是可行的，但是微孔加工成本高，質量也難以保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]該發(fā)明要解決的關鍵問題是將蛋白質溶液或者將固定在微小磁珠或量子點上的蛋白質連同水，通過物理方法固定在芯片基板上，形成實用的蛋白質芯片。為解決上述技術問題，本發(fā)明首先通過刻蝕辦法在單晶硅片上制備出每個陣點具有筒狀結構的陰模；然后采用可硬化透明材料填充陰模即可將陰模上的筒形結構轉變?yōu)楸砻嫱怀龅耐?；這些呈陣列分布的微小的筒作為蛋白質溶液的容器，筒內(nèi)壁經(jīng)過親水處理，可以較好地固定蛋白質溶液并保持其生物活性；在微筒的側面有狹窄的縫隙，一方面在吸取蛋白液時起到排氣的作用，另一方面在檢測時起到增大與環(huán)境液體或氣體接觸面的作用。
【附圖說明】
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[0006]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0007]圖1是單筒式陣列陰模三維透視圖。
[0008]圖2是多筒式陣列陰模三維透視圖。
[0009]圖3是芯片一級陣列和二級陣列示意圖。
[0010]圖4是單筒式蛋白質芯片三維效果圖。
[0011]圖5是多筒式蛋白質芯片三維效果圖。
【具體實施方式】
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[0012]第一步是設計陣列及花樣設計。
[0013]首先是根據(jù)使用需求和制造工藝設計單個陣點對應筒的結構。筒的結構設計為柱形，優(yōu)選為圓柱形設計，以避免拐角處應力集中。筒外徑10-100微米，高度10-100微米，筒壁厚3-10微米；每個筒側面開有1-4條狹縫，狹縫寬度1-5微米。筒可以是單筒，也可以是厚3-10微米肋片分割成的復合筒。
[0014]圖1和圖2分別對應單筒和多筒兩種優(yōu)選設計實例。對于圖1所示單筒結構，筒外徑50微米，壁厚5微米，筒深30微米，筒壁有一條狹縫，狹縫寬2微米。圖2對應多筒結構，一個圓柱形筒被內(nèi)部十字形肋片分割為四個近似三棱柱形筒，每個小筒向外的側面有一條狹縫；圓柱外徑50微米，壁厚5微米，肋片厚5微米，筒高30微米，狹縫寬2微米。
[0015]接下來設計筒陣列。考慮到顯微檢測的方便性、檢測結果的重復性以及檢測的種類，陣列可以從2X2到1X 10甚至更多。由筒組成的一級陣列還可以作為復合陣點構建更大的二級陣列。
[0016]圖3是一個付諸制造的陣列設計實例:一級陣列為5X5，陣列周期為100微米；二級陣列也是5 X 5，陣列周期為I毫米；單張芯片尺寸為1X 10毫米。
[0017]第二步是根據(jù)以上設計制作光刻掩模，可委托專業(yè)服務機構完成。
[0018]第三步是利用掩模在單晶硅片上進行光刻制作陰模，也由專業(yè)服務機構完成。
[0019]第四步是翻模制作蛋白質芯片基板。將單晶硅陰模固定在耐熱容器底部，陣列花樣朝上；根據(jù)容器大小和芯片厚度1-5毫米注入適量可硬化有機透明液體；真空脫氣；在干燥箱中烘干硬化；將彈性基板從單晶硅陰模上揭下。作為實例，選用聚二甲基硅氧烷商品，按說明書將兩組份混合，用量按照芯片厚度為I毫米計算，容器為石英培養(yǎng)皿，真空度取0.01兆帕，脫氣時間I小時，烘干溫度80度，烘干時間5小時。圖4和圖5分別為依照以上兩個設計實例翻模制備的蛋白質芯片基板三維效果圖。
[0020]第五步是加載蛋白液。可以采用氣壓、液壓、電泳或直接毛細吸附等多種辦法實現(xiàn)。
[0021]作為一個實例，采用已申請專利的實時定量檢測毛細管電泳蛋白質芯片制備裝置(申請?zhí)?01210539488.6)，該裝置可以采用電泳工作方式或氣壓方式通過石英毛細管精確加載，根據(jù)芯片陣點筒大小選取內(nèi)徑25-100微米毛細管，對于以上兩個設計實例，選用內(nèi)徑50微米毛細管，10干伏電壓,持續(xù)I秒。
[0022]另一實例是將固定在直徑20微米磁珠或量子點上的蛋白質溶液涂敷在親水的蓋玻片表面，厚度5-20微米；將圖5型芯片基板的陣列花樣面向下壓在蓋玻片表面，基板變形量5-10微米，保持I秒鐘即可。該實例中，一方面，蛋白液通過毛細作用進入陣列筒；另一方面，量子點或磁珠的直徑稍大于陣列筒的內(nèi)徑，下壓芯片基板時借助基板彈性被強制嵌入筒內(nèi)，這種空間卡位辦法起到加強蛋白固定的作用。
[0023]第六步是蛋白質芯片的物理再生處理。采用超生波清洗機，先加入去離子水和洗滌劑清洗1-2遍，再用干凈去離子水清洗2-3遍，置于烘干箱70-90度烘干0.5-3小時即可。
【主權項】
1.一種制備可物理再生蛋白質芯片的方法，包括硅片光刻制備模板、透明有機物聚合硬化翻模制備芯片基板、蛋白質溶液加載形成芯片等步驟，其特征在于:光刻模板為陰模，經(jīng)過翻模制備的蛋白質芯片基板上的陣點為突出基板表面的柱形微筒，微筒外徑10-100微米，高度10-100微米，筒壁厚3-10微米。
2.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于:在柱形筒內(nèi)部添加厚度3-10微米肋片，使一個陣點上的一個筒變?yōu)榘瑪?shù)個小筒的復合筒。
3.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于:在每個筒的側面開有1-4條寬度1-5微米的狹縫，在加載蛋白質溶液時作為排氣通道。
4.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于:蛋白質溶液通過毛細管電泳或毛細吸入加載到陣點上的微筒內(nèi)，蛋白質溶液的溶劑起到保持蛋白質活性的作用。
5.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于:通過壓力將固定在直徑稍大于微筒內(nèi)徑的磁珠或量子點上的蛋白質連同其結合的溶劑一起壓入微筒，微筒借助空間卡位將磁珠或量子點連同蛋白質和溶劑固定。
6.按照權利要求4、權利要求5所述的制備方法，其特征在于:由于蛋白液借助物理方法被固定在芯片陣點上的微筒中，在芯片使用完畢后，可以使用超聲波清洗等物理方法清除蛋白質溶液、磁珠或量子點，實現(xiàn)芯片的物理再生和循環(huán)使用。
【專利摘要】發(fā)明“一種制備可物理再生蛋白質芯片的方法”涉及采用毛細吸附和空間卡位的方法將蛋白質溶液固定到陣列化微筒中的技術方法，旨在解決芯片難以保持蛋白質活性和一次性使用成本高的問題。該方法先利用硅片光刻技術制作陰模；之后將可聚合有機物液體涂敷在陰模表面，經(jīng)真空脫氣和加熱聚合硬化，將透明彈性蛋白質芯片基板從陰模上揭下，得到具有一級或兩級陣列的、每個一級陣點一筒或一點多筒的陣列；利用毛細管電泳三維點樣技術或者壓力接觸將蛋白質溶液加載到微筒內(nèi)，最終獲得蛋白質芯片。微筒側面設計有狹縫，在下壓時起到排氣通道的作用。該微筒儲液型蛋白質芯片在使用完畢后可通過超聲波清洗和干燥處理等物理方法再生，實現(xiàn)循環(huán)使用。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號】CN104749373
【申請?zhí)枴緾N201310739794
【發(fā)明人】倉懷興, 張力, 段秉亞, 馬建華
【申請人】中國科學院生物物理研究所
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2013年12月30日