一種甲胎蛋白異質(zhì)體的分離檢測組合物、系統(tǒng)及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種甲胎蛋白異質(zhì)體的分離檢測組合物、系統(tǒng)、方法及應用，同時還涉 及了一種甲胎蛋白異質(zhì)體的分離檢測試劑盒，屬于醫(yī)療器械及體外診斷領域。
【背景技術】
[0002] 肝細胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)第四位常見的惡性腫 瘤，每年大約有250000名患者死于肝細胞癌，肝細胞癌的發(fā)病機制至今仍未清楚，其在臨 床上惡性度較高，死亡率在消化道惡性腫瘤中排第三位，所以早期發(fā)現(xiàn)、早期治療是提高患 者生存率的關鍵，而大多數(shù)患者就診時已屆中晚期，失去了最佳治療時機，危險因素包括由 乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒導致的慢性肝炎和肝硬化。要得到有效治療，篩查和普查的 臨床效率依賴于早期診斷。HCC是腫瘤病因?qū)W中的重要類型，肝硬化、病毒性肝炎、化學致癌 物及環(huán)境因素等所造成的慢性肝臟損害都可誘發(fā)HCC。HCC惡性度高，容易復發(fā)及轉(zhuǎn)移，預 后差，而且早期診斷較困難，易于延誤最佳治療期。
[0003] 甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP)是一種糖蛋白，檢測血液中的AFP含量是目前 診斷肝癌最常見的手段。AFP在哺乳動物胚胎期由肝臟實質(zhì)細胞和卵黃囊細胞合成，來源于 內(nèi)胚層的胃腸道粘膜細胞也可少量合成。正常情況下，AFP主要存在于胎兒循環(huán)中，隨著胎 兒發(fā)育成熟，AFP合成逐漸減少。出生時臍血中AFP濃度可達10~100mg/L，出生后一年降 至正常成人水平。如果新生兒AFP明顯升高提示新生兒肝炎、先天性膽道閉鎖或有能分泌 AFP的胚胎性惡性腫瘤。AFP作為早期肝癌診斷指標的缺點是在肝病和肝硬化疾病中也有 相當?shù)谋壤嬖陉栃越Y(jié)果，AFP輕度增高（20~200ng/ml)見于相當數(shù)量的慢性肝病患者， 在肝硬化患者中11. 7-44%AFP陽性。因此在分辨良性肝病和惡性肝腫瘤時，AFP作為早期 肝癌篩查指標的價值大為降低。
[0004]AFP異質(zhì)體許多糖鏈的結(jié)構尚未完全明了。目前認為，通常所說的AFP異質(zhì)體實 際是指與LCA結(jié)合的AFP-L3,1999年第四屆全國肝癌學術會議將其列為原發(fā)性肝癌臨床 診斷標準的肝癌標記物之一。2011年中國肝癌診療規(guī)范將AFP-L3列為肝癌診斷特異性指 標；多年來，AFP-L3被公認為是比單純的AFP甲胎蛋白更為特異的原發(fā)性肝癌指標。
[0005]AFP-L3是唯一由患者肝臟中癌細胞生成的蛋白。在加拿大和美國的一項多中心、 前瞻性、雙盲、長期臨床試驗中，對該檢測方法進行了研宄。結(jié)果顯示AFP-L3%升高（15% 以上）的患者，在接下來的21個月中，發(fā)生肝細胞癌的危險增加7倍之多。根據(jù)已有的肝 細胞癌腫瘤學實踐指南，這些患者肝細胞癌發(fā)生率極端增高。
[0006]AFP異質(zhì)體檢測的臨床意義：
[0007] 1)鑒別肝癌與良性肝病。原發(fā)性肝癌患者AFP常升高，但許多良性肝臟疾病也可 有AFP升高，單憑AFP結(jié)果有時很難區(qū)分良、惡性病變。此時AFP異質(zhì)體檢測就具有良好的 臨床意義，尤其對于AFP在30~400ng/ml之間者具有較好的價值。Yozhiaki對361例肝 硬化進行了前瞻性研宄，在53例AFP在30ug/L以上的患者中，2年以后21例發(fā)展為肝癌， 確診肝癌時39%的患者AFP在400ug/L以下。對比研宄開始時肝細胞肝癌（HCC)組與非 HCC組AFP測定值，未發(fā)現(xiàn)差異有顯著性，研宄發(fā)現(xiàn)病變時AFP異質(zhì)體的類型有所不同，對HCC診斷LCA陽性率87. 12%假陽性率21. 5%，ConA陽性率89. 17%，假陽性率17. 15%。 目前的研宄結(jié)果把AFP-L3含量大于15%作為肝癌的陽性指標。
[0008] 2)肝癌術后的監(jiān)測。肝癌切除術后，血清AFP含量隨之下降，其下降速度取決于體 內(nèi)殘留AFP量及半衰期，一般2月內(nèi)轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰時AFP異質(zhì)體隨之消失。如果AFP明顯下降 但不轉(zhuǎn)陰，異質(zhì)體變化不明顯，則提示手術不徹底，可能還存在邊緣殘留、血管癌栓、衛(wèi)星結(jié) 節(jié)或轉(zhuǎn)移等。如果異質(zhì)體下降至25%以下，AFP和異質(zhì)體濃度相對恒定，則可能是患者有肝 炎或肝硬化所致。
[0009] 3)胚胎異常發(fā)育及胎兒先天性疾患。正常妊娠期母體血清中AFP與胚胎中AFP處 于平衡狀態(tài)，一旦胎兒畸形或胎盤屏障發(fā)生異常，可導致胎兒血清滲入羊水中或羊水滲入 母體血清，造成母體羊水或血清AFP急劇升高。但僅僅測定AFP總量有一定的局限性。實 驗表明神經(jīng)管缺損、無腦兒或脊柱裂等。兒童肝母細胞瘤、膽道閉鎖、性腺腫瘤、惡性畸胎瘤 等可有AFP和/或AFP異質(zhì)體的陽性。
[0010] 目前用于AFP異質(zhì)體的檢測方法有植物凝集素親和層析法、聚丙烯酰胺凝膠電泳 法、親和印跡法、親和交叉免疫電泳法，這些方法均可以直接分離出AFP-L3蛋白并且進行 定量估算，依據(jù)最終檢測方法可以分為：
[0011] 考馬斯亮蘭法：電泳后的標本直接用考馬斯亮蘭染色，洗脫后觀察峰帶。方法簡 單，但干擾因素多，靈敏度約l〇〇〇ug/L。
[0012] 酶標法：用過氧化物酶標記的抗體與電泳后的標本一起溫育、漂洗后用二氨基聯(lián) 苯胺顯色，檢測靈敏度可提高至50ug/L。
[0013] 金銀染色法：將電泳后的標本直接與金黃色葡萄球菌蛋白A2膠金溫育，再用銀顯 色液顯色，得到的峰帶清晰，靈敏度可達32ug/L。
[0014]放射自顯影法：是我國迄今為止最常用的檢測方法，靈敏度達31ug/L。其原理是 將標本在含凝集素的凝膠中進行分離電泳，后在添加含125IAFP、抗AFP抗體的凝膠中進行 二次電泳，電泳結(jié)束后將凝膠烘干，覆蓋X線膠片爆光，沖洗成像。整個實驗過程操作復雜， 長期以來，國內(nèi)只有少數(shù)臨床實驗室能夠測定AFP異質(zhì)體，少數(shù)城市能滿足臨床測定AFP異 質(zhì)體的要求，并且沒有國產(chǎn)試劑供應。
[0015] 另外目前國內(nèi)主要采用離心管分離方法，該方法采用瓊脂糖偶聯(lián)LCA，采用離心方 法分離AFP-L3,然后再用AFP試劑進行檢測。離心管分離方法是目前國內(nèi)唯一獲得藥監(jiān)局 批準適用于AFP-L3%檢測的方法。
[0016] 現(xiàn)有方法對甲胎蛋白異質(zhì)體占比測定中，手工操作程序多，步驟繁瑣，需要配套設 備多，耗時長，且不能實現(xiàn)自動化，因此，無法實現(xiàn)高通量的樣本檢測，并且受到人工操作影 響較大，最終會引起檢測結(jié)果的偏差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種甲胎蛋白異質(zhì)體的分離檢測組合 物、系統(tǒng)、方法及應用，通過檢測血液樣本中甲胎蛋白異質(zhì)體含量與甲胎蛋白含量，得到甲 胎蛋白異質(zhì)體占比。
[0018] 本發(fā)明提供的一種甲胎蛋白異質(zhì)體的分離檢測組合物，包括分離試劑和檢測試 劑，所述分離試劑包括偶聯(lián)凝集素的磁性顆粒和洗脫液，所述偶聯(lián)凝集素的磁性顆粒用于 與待檢測樣品中的AFP-L3特異性結(jié)合；所述檢測試劑包括包被甲胎蛋白抗體的磁性顆粒、 標記酶的抗甲胎蛋白抗體。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述分離檢測組合物優(yōu)選技術方案。
[0020] 作為優(yōu)選，所述分離試劑還包括保護液，用于增加分離試劑的穩(wěn)定性及提高分離 效率。
[0021] 作為優(yōu)選，所述檢測試劑還包括緩沖液，用于增加檢測試劑的穩(wěn)定性、提高檢測靈 敏度以及檢測特異性。
[0022] 作為優(yōu)選，所述分離試劑和/或檢測試劑還包括清洗液，用于提高結(jié)合效率、降低 非特異性吸附、提高分離和檢測的靈敏度。
[0023] 作為優(yōu)選，所述偶聯(lián)凝集素的磁性顆粒中凝集素包括小扁豆凝集素和/或刀豆凝 集素。
[0024] 作為優(yōu)選，所述偶聯(lián)凝集素的磁性顆粒中磁性顆粒表面覆蓋的高分子成分包括硅 化物、多聚糖、蛋白、纖維素或樹脂。
[0025] 作為優(yōu)選，所述組合物以卡式或條式提供。
[0026] 本發(fā)明進一步提供了一種甲胎蛋白異質(zhì)體的分離檢測試劑盒，包括上述分離檢測 組合物。
[0027] 本發(fā)明又進一步提供了一種甲胎蛋白異質(zhì)體的分離檢測系統(tǒng)，包括：
[0028] 磁分離模塊，用于自液體中分離磁顆粒，磁分離模塊配合分離試劑和檢測試劑使 用；
[0029] 檢測模塊，用于檢測甲胎蛋白異質(zhì)體和甲胎蛋白含量；
[0030] 數(shù)據(jù)處理模塊，用于計算甲胎蛋白異質(zhì)體相對于甲胎蛋白比值，和
[0031] 任一種的上述分離檢測組合物或上述試劑盒。
[0032] 所述磁分離模塊與所述分離檢測組合物中的分離試劑相配合，用于完成對甲胎蛋 白異質(zhì)體的分離；
[0033] 所述檢測模塊與所述分離檢測組合物中的檢測試劑相配合，用于完成對甲胎蛋白 異質(zhì)體的含量和甲胎蛋白含量的檢測。
[0034] 本發(fā)明還提供了上述分離檢測系統(tǒng)的優(yōu)選技術方案。
[0035] 作為優(yōu)選，
[0036] 當選擇測定甲胎蛋白含量時，所述磁分離模塊不與分離試劑相配合，所述檢測裝 置檢測待檢測樣品中甲胎蛋白的含量，
[0037] 當選擇測定甲胎蛋白異質(zhì)體含量時，所述磁分離模塊分離待檢測樣品中甲胎蛋白 異質(zhì)體，所述檢測模塊檢測待檢測樣品中甲胎蛋白異質(zhì)體的含量；
[0038] 當選擇測定甲胎蛋白異質(zhì)體占比時，所述磁分離模塊分離待檢測樣品中甲胎蛋白 異質(zhì)體，所述檢測模塊檢測待檢測樣品中甲胎蛋白異質(zhì)體的含量和甲胎蛋白的含量，所述 數(shù)據(jù)處理模塊計算甲胎蛋白異質(zhì)體占比，即甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP-L3)在總甲胎蛋白（AFP) 中的占比（AFP-L3% )。
[0039] 本發(fā)明最后提供了一種上述分離檢測組合物或上述分離檢測系統(tǒng)在分離檢測甲 胎蛋白異質(zhì)體中的應用。
[0040] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：操作者只需要加入樣本等簡單操作，在 30分鐘內(nèi)就可以完成檢測；同時該方法可以直接通過檢測而定量計算出血樣標本中所含 的甲胎蛋白和甲胎蛋白異質(zhì)體的含量，并同時獲得AFP-L3%;方法簡便，檢測快捷，結(jié)果準 確，靈敏度高，且自動化，為肝癌的預防、診斷、治療提供了支持。
【附圖說明】
[0041] 圖1是本發(fā)明的甲胎蛋白異質(zhì)體的分離檢測組合物以卡式提供示意圖，
[0042] 其中，1-樣本孔，2-裝有偶聯(lián)凝集素的磁性顆粒的試劑槽，3-裝有洗脫液的試劑 槽，4-裝有包被甲胎蛋白單抗的磁性顆粒的試劑槽，5-裝有標記酶的抗甲胎蛋白抗體的試 劑槽，6-反應孔，7-試劑卡；
[0043]圖2是本發(fā)明的甲胎蛋白異質(zhì)體的分離檢測系統(tǒng)的示意圖。
【具體實施方式】
[0044] 以下結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的 具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0045] 實施例1
[0046] 本發(fā)明提供的甲胎蛋白異質(zhì)體的分離檢測組合物，包括分離試劑和檢測試劑，用 于檢測甲