高空間分辨激光分光瞳差動共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于共焦顯微成像技術、光譜成像技術和質(zhì)譜成像技術領域，將分光瞳差動共焦顯微成像技術、質(zhì)譜成像技術和光譜探測技術相結(jié)合，涉及一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，可用于生物質(zhì)譜的高分辨成像。
技術背景
[0002]質(zhì)譜儀(Mass Spectrometry)是將樣品中的組分發(fā)生電離，使生成的不同荷質(zhì)比的帶電原子、分子或分子碎片在電場和磁場的作用下分別聚焦而得到按質(zhì)荷比大小順序排列的圖譜儀器。質(zhì)譜成像是對樣品二維區(qū)域內(nèi)多個微小區(qū)域分別進行質(zhì)譜分析來檢測特定質(zhì)荷比(m/z)物質(zhì)的分布。
[0003]自上世紀80年代中期基質(zhì)輔助激光解吸電離這種高靈敏度和高質(zhì)量檢測范圍生物質(zhì)譜成像技術的出現(xiàn)，開拓了質(zhì)譜學一個嶄新的領域一生物質(zhì)譜，促使質(zhì)譜技術應用范圍擴展到生命科學研宄的眾多領域，特別是質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、核酸、糖蛋白分析等方面的應用，不僅為生命科學研宄提供了新手段，而且也促進了質(zhì)譜技術自身的發(fā)展。
[0004]但現(xiàn)有基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜儀存在以下突出問題:
[0005]I)由于利用簡單的激光聚焦來解吸電離樣品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、質(zhì)譜探測空間分辨力不高等問題；
[0006]2)無法對中性原子、分子、中離子及基團等進行探測，其結(jié)果制約了樣品質(zhì)譜成分的準確完整獲?。?br>[0007]3)質(zhì)譜成像所需時間長，激光質(zhì)譜儀聚焦光斑軸向位置相對被測樣品常發(fā)生漂移冋題。
[0008]而生物樣品“微區(qū)”完整組分信息的準確獲取對于生命科學研宄具有極其重要的意義。事實上，如何高靈敏地探測微區(qū)質(zhì)譜信息是目前生物質(zhì)譜領域亟待研宄的重要技術冋題。
[0009]實事上，強脈沖激光聚焦到樣品表面會使樣品離子化，可激發(fā)出帶電的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中離子等。如何能夠完整地獲取帶電的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中離子的信息，對于高精度分析樣品的組分具有重要意義。
[0010]利用激光誘導擊穿光譜(LIBS)技術可測量等離子體發(fā)射光譜信息，獲得樣品中元素成分。將激光誘導擊穿光譜(LIBS)技術與質(zhì)譜探測技術相結(jié)合，可用來彌補激光質(zhì)譜成像技術中無法獲得中性原子、分子和中離子信息的不足。
[0011 ] 激光共焦顯微鏡“點照明”和“點探測”的成像探測機制，不僅使其橫向分辨力較同等參數(shù)的光學顯微鏡改善1.4倍，而且還使共焦顯微鏡極便于與超分辨光瞳濾波技術、徑向偏振光緊聚焦技術等結(jié)合來壓縮聚焦光斑，進一步實現(xiàn)高空間分辨顯微成像。
[0012]基于此，本發(fā)明提出一種高空間分辨力的激光分光瞳差動共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，其創(chuàng)新在于:首次將具有高空間分辨能力分光瞳差動共焦顯微技術與激光誘導擊穿光譜(LIBS)技術和質(zhì)譜探測技術相融合，可實現(xiàn)被測樣品微區(qū)高空間分辨和高靈敏形態(tài)與組分的成像與探測。
[0013]本發(fā)明一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置可為生物質(zhì)譜高分辨成像提供一個全新的有效技術途徑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0014]本發(fā)明的目的是為了提高質(zhì)譜成像的空間分辨能力、抑制成像過程中聚焦光斑相對樣品的漂移，提出一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，以期同時獲得被測對象成分空間信息和功能信息。本發(fā)明將激光分光瞳差動共焦顯微鏡聚焦光斑的探測功能與激光聚焦解吸電離功能相融合，利用經(jīng)超分辨技術處理的分光瞳差動共焦顯微鏡的微小聚焦光斑對樣品進行高空間分辨形態(tài)成像，利用質(zhì)譜探測系統(tǒng)對分光瞳差動共焦顯微系統(tǒng)聚焦光斑解吸電離樣品而產(chǎn)生的帶電分子、原子等進行微區(qū)質(zhì)譜成像，利用光譜探測系統(tǒng)對分光瞳差動共焦顯微系統(tǒng)聚焦光斑解吸電離樣品而產(chǎn)生的等離子體發(fā)射光譜信息進行光譜成像，然后再通過探測數(shù)據(jù)信息的融合與比對獲得完成的樣品成分信息，繼而實現(xiàn)被測樣品微區(qū)高空間分辨和高靈敏形態(tài)與組分的成像與探測。
[0015]本發(fā)明的目的是通過下述技術方案實現(xiàn)的。
[0016]本發(fā)明的一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法，其利用高空間分辨分光瞳差動共焦顯微系統(tǒng)的聚焦光斑對樣品進行軸向定焦與成像，利用質(zhì)譜探測系統(tǒng)對分光瞳差動共焦顯微系統(tǒng)聚焦光斑解吸電離樣品而產(chǎn)生的帶電分子、原子等進行微區(qū)質(zhì)譜成像，利用光譜探測系統(tǒng)對分光瞳差動共焦顯微系統(tǒng)聚焦光斑解吸電離樣品而產(chǎn)生的等離子體發(fā)射光譜進行探測，然后再通過探測數(shù)據(jù)信息的融合與比對分析繼而實現(xiàn)被測樣品微區(qū)高空間分辨和高靈敏形態(tài)與組分的同時成像與探測，其包括以下步驟:
[0017]步驟一、使平行光束通過沿入射光軸方向放置的壓縮聚焦光斑系統(tǒng)、D型照明收集鏡中的D型照明光瞳聚焦到被測樣品上解吸電離產(chǎn)生等離子體羽；
[0018]步驟二、使計算機控制三維工作臺帶動被測樣品沿測量面法線方向在D型照明收集鏡焦點附近上下移動，利用采集光軸方向的D型收集光瞳、采集透鏡和位于采集透鏡焦點的光強點探測器對被測樣品反射的測量光束進行聚焦探測得到分光瞳共焦軸向強度曲線；
[0019]步驟二、使計算機控制三維工作臺帶動被測樣品沿測量面法線方向在D型照明收集鏡焦點附近上下移動，利用沿采集光軸方向放置的D型收集光瞳、采集透鏡、中繼放大透鏡和位于中繼放大透鏡焦面并關于采集光軸對稱放置的第一光強點探測器和第二光強點探測器對放大艾里進行分割探測，得到艾里斑第一微區(qū)和艾里斑第二微區(qū)的強度特性曲線分別為第一離軸共焦軸向強度曲線和第二離軸共焦軸向強度曲線；
[0020]步驟三、將第一離軸共焦軸向強度曲線和第二離軸共焦軸向強度曲線相減處理得到分光瞳差動共焦軸向強度曲線；
[0021]步驟四、計算機依據(jù)分光瞳差動共焦軸向強度曲線的零點位置zA值控制三維工作臺帶動被測樣品沿測量面法線方向運動，使D型照明收集鏡的聚焦光斑聚焦到被測樣品上;
[0022]步驟五、利用電離樣品吸管將聚焦光斑解吸電離被測樣品產(chǎn)生的等離子體羽中的分子、原子和離子吸入質(zhì)譜探測系統(tǒng)中進行質(zhì)譜成像，測得對應聚焦光斑區(qū)域的質(zhì)譜信息;
[0023]步驟六、利用由D型照明收集鏡、D型收集光瞳、采集透鏡、中繼放大透鏡、第一光強點探測器和第二光強點探測器和三維工作臺構成的激光分光瞳差動共焦探測系統(tǒng)對聚焦到被測樣品的微區(qū)進行成像，測得對應聚焦光斑區(qū)域的形態(tài)信息；
[0024]步驟七、利用光譜探測系統(tǒng)對經(jīng)分色器反射和光譜收集透鏡收集的激光誘導擊穿光譜進行探測，測得對應聚焦光斑區(qū)域的光譜信息；
[0025]步驟八、計算機將激光分光瞳差動共焦探測系統(tǒng)測得的激光聚焦微區(qū)形態(tài)信息、光譜探測系統(tǒng)同時探測的激光聚焦微區(qū)的激光誘導擊穿光譜信息、質(zhì)譜探測系統(tǒng)同時測得的激光聚焦微區(qū)的質(zhì)譜信息進行融合處理，繼而得到聚焦光斑微區(qū)的形態(tài)、光譜和質(zhì)譜信息;
[0026]步驟九、計算機控制三維工作臺使D型照明收集鏡焦點對準被測樣品的下一個待測區(qū)域，然后按步驟二?步驟八進行操作，得到下一個待測聚焦區(qū)域的形態(tài)和質(zhì)譜信息；
[0027]步驟十、重復步驟九直到被測樣品上的所有待測點均被測到，然后利用計算機進行處理即可得到被測樣品形態(tài)信息和質(zhì)譜信息。
[0028]本發(fā)明高空間分辨激光分光瞳差動共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法中，包括步驟一可以為使平行光束通過沿入射光軸方向放置的矢量光束發(fā)生系統(tǒng)、光瞳濾波器后整形為環(huán)形光束，該環(huán)形光束再經(jīng)圓形照明收集鏡聚焦到被測樣品上解吸電離產(chǎn)生等離子體羽。
[0029]本發(fā)明高空間分辨激光分光瞳差動共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像方法中，包括D型照明收集鏡中D型照明光瞳和D型收集光瞳的照明收集功能可以通過圓形照明收集鏡中圓形照明光瞳和圓形收集光瞳來完成。
[0030]本發(fā)明的一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像裝置，包括點光源、沿入射光軸方向放置的準直透鏡、壓縮聚焦光斑系統(tǒng)和聚焦光斑到被測樣品的D型照明收集鏡的D型照明光瞳，包括沿采集光軸方向放置的D型照明收集鏡的D型收集光瞳、采集透鏡、中繼放大透鏡和位于中繼放大透鏡焦面并關于光軸對稱放置的第一光強點探測器和第二光強點探測器，還包括探測激光誘導擊穿光譜的分色鏡、光譜收集透鏡和光譜探測系統(tǒng)，以及用于D型照明收集鏡聚焦光斑解析電離的離子體羽組分的電離樣品吸管和質(zhì)譜探測系統(tǒng)，入射光軸和采集光軸之間的夾角為2α，并關于測量面法線對稱。
[0031]本發(fā)明的一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦光譜-質(zhì)譜顯微成像裝置中，包括壓縮聚焦光斑系統(tǒng)可以用沿入射光軸方向放置的產(chǎn)