每個納米顆粒通過遺傳 修飾表面均勻連接M個生物素，所述M > 12,且M為整數(shù)；通過調(diào)整所述生物素化的納米顆 粒與親和素修飾的酶的比例得到酶納米復合物。
[0031] 優(yōu)選的，當生物素化的納米顆粒與親和素修飾的酶按物質(zhì)的量比大于I :M時，復 合物形成多聚體，當比例小于等于I :M時，復合物為單體。
[0032] 優(yōu)選的，所述納米顆粒為鐵蛋白納米顆粒，每個鐵蛋白納米顆粒通過遺傳修飾表 面均勻連接24個生物素，生物素化的鐵蛋白納米顆粒與親和素修飾的酶按物質(zhì)的量比為 1 :20 ~30。
[0033] 優(yōu)選的，所述生物素化的鐵蛋白納米顆粒與親和素修飾的酶按物質(zhì)的量比為1 : 20~23. 5。得到的酶-鐵蛋白納米復合物為多聚體，且通過調(diào)整兩者之間的比例，酶-鐵 蛋白納米復合物尺寸可控、均勻，能夠負載更多的酶分子，進一步提高檢測靈敏度。更為優(yōu) 選的，所述生物素化的鐵蛋白納米顆粒與親和素修飾的酶按物質(zhì)的量比為1 :20或1 :22或 I ：23. 5〇
[0034] 優(yōu)選的，所述每個納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接M個生物素包括：
[0035] 通過分子克隆在所述納米顆粒亞基的N末端融合生物素接受多肽（biotin accepted peptide, BAP)得到融合蛋白基因，將所述融合蛋白基因克隆入表達載體；
[0036] 將生物素蛋白連接酶（Biotin-protein ligase, BirA)克隆入共表達載體中； [0037] 將所述表達載體、共表達載體轉(zhuǎn)入表達宿主中培養(yǎng)，活化至對數(shù)生長期后加入誘 導表白蛋白和生物素；
[0038] 經(jīng)破碎、純化后制得生物素化的納米顆粒。
[0039] 優(yōu)選的，所述納米顆粒為鐵蛋白納米顆粒，鐵蛋白包括24個相同或同源的 亞基；更為優(yōu)選的，鐵蛋白為重組人重鏈鐵蛋白（recombinant human heavy-chain ferritin, rHF)〇
[0040] 優(yōu)選的，通過分子克隆在所述納米顆粒亞基的N末端融合連接多肽之后再融合生 物素接受多肽得到融合蛋白基因。減少可能存在的位阻的影響，保持生物素接受多肽遠離 納米顆粒的表面。
[0041] 優(yōu)選的，所述表達載體和所述共表達載體為質(zhì)粒載體，所述表達宿主選自大腸桿 菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、棒狀桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母或哺乳動物細胞。更為優(yōu) 選的，所述表達載體為ρΕΤ-28、ρΕΤ-32、ρΕΤ-15或ρΕΤ-11，所述共表達載體為pCDFDuel-1， 所述表達宿主為大腸桿菌。
[0042] 優(yōu)選的，所述克隆通過鏈式酶聚合反應（PCR)完成。
[0043] 優(yōu)選的，將生物素蛋白連接酶（BirA)克隆入共表達載體中具體包括：獲取BirA基 因的核苷酸序列，設計引物，在上、下游引物中分別加入限制性內(nèi)切酶NcoI和Sail的酶切 位點，通過PCR擴增BirA基因；將PCR產(chǎn)物BirA和表達載體p⑶FDuel-I進行雙酶切反應， 收集酶切產(chǎn)物；將收集到的酶切產(chǎn)物BirA和p⑶FDuel-I載體按物質(zhì)的量比以6 :1進行連 接反應，得到 BirA-pCDFDuel-1。
[0044] 優(yōu)選的，將所述表達載體、共表達載體轉(zhuǎn)入表達宿主中培養(yǎng)，活化至對數(shù)生長期后 加入誘導表白蛋白和生物素具體包括：將表達載體和共表達載體加入含有表達宿主和抗生 素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，直至活化至對數(shù)生長期，加入IPTG誘導表白蛋白和生物素過夜， 進行培養(yǎng)和表達。
[0045] 優(yōu)選的，經(jīng)破碎、純化后制得生物素化的納米顆粒具體包括：收集表達后的產(chǎn)物進 行超聲破粹，收集上清液，水浴反應后離心，收集上清液利用蔗糖密度梯度離心或凝膠排阻 層析收集納米顆粒。
[0046] 優(yōu)選的，所述酶為辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶或堿性磷酸酶。
[0047] 進一步的，本發(fā)明還提供一種用于免疫分析的試劑盒，所述試劑盒包括生物素化 的納米顆粒以及親和素修飾的酶，所述納米顆粒為由M個相同或同源的亞基通過自組裝形 成的球形納米顆粒,每個納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接M個生物素，所述M > 12,且 M為整數(shù)。在使用時，將生物素化的蛋白納米顆粒和親和素修飾的酶按一定的比例進行混 合，即可制得不同尺寸的ENC。試劑盒中也可包括預制好的ENC試劑，在免疫反應中無需混 合直接使用即可。優(yōu)選的，所述酶可為辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶。優(yōu)選 的，所述納米顆粒為鐵蛋白納米顆粒，每個鐵蛋白納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接24 個生物素。
[0048] 此外，本發(fā)明還提供一種酶納米復合物在免疫分析中的應用。
[0049] 本發(fā)明有益效果：
[0050] 1、靈敏度高。酶納米復合物（enzyme nan〇-composite，ENC)通過可控自組裝整合 了大量的酶分子，相較于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法，其檢測靈敏度提高了 1000~10000倍。
[0051] 2、可控性好。通過本發(fā)明制備方法制得的ENC在不同比例下具有不同的聚集狀 態(tài)，所含有的酶分子數(shù)量在一定范圍內(nèi)穩(wěn)定，從而使批次間的穩(wěn)定性提高，批次內(nèi)的可定量 性好。
[0052] 3、方法簡單、成本低?；贓NC的高靈敏ELISA是在現(xiàn)有的商業(yè)化試劑中添加一 種試劑即可達到，可自己添加，也可制備出預制試劑，靈活方便。相比化學發(fā)光和電化學檢 測，不需要專用的儀器設備和人員培訓，并達到化學發(fā)光和電化學放光方法的靈敏度。
【附圖說明】
[0053] 圖1生物素化鐵蛋白納米顆粒制備的示意圖。
[0054] 圖2生物素化納米顆粒的電子顯微鏡表征。
[0055] 圖3生物素化納米顆粒的動態(tài)光散射表征尺寸。
[0056] 圖4western blot測定生物素化納米顆粒與SA-HRP的結(jié)合能力。
[0057] 圖5生物素化納米顆粒的生物素化效率。
[0058] 圖6ENC的可控制備。a、在SA-HRP飽和與過飽和的情況下ENC形成含有一個 BAP-rHF納米顆粒的單體；b、二聚體的形成；c、BAP-rHF納米顆粒需要與相鄰顆粒共享兩個 SA-HRP時，所形成的三聚體、四聚體；d、基于ENC的超靈敏ELISA示意圖。
[0059] 圖7不同組裝比例的ENC的電子顯微鏡表征。
[0060] 圖8間接ELISA檢測抗HIV p24抗體的血清模擬樣品。
[0061] 圖9夾心ELISA檢測cTnl模擬樣品。
[0062] 圖10基于ENC的cTnl實際樣品檢測（a)與使用傳統(tǒng)ELISA方法的比較（b)。左 邊為17個確認發(fā)生AMI的病人樣品，右邊為健康人樣品檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0063] 本發(fā)明【具體實施方式】、實施例中"遺傳修飾"指的是通過分子生物學技術(shù)對生物 體的基因組進行遺傳修飾，所得到的基因組成和性狀改變。"鐵蛋白納米"為由24個相同 或同源的亞基構(gòu)成的具有空腔結(jié)構(gòu)的球形蛋白納米顆粒。此外，小鐵蛋白為由12個相同 或同源的亞基構(gòu)成的具有空腔結(jié)構(gòu)的球形蛋白納米顆粒。"親和素"包括但不限于親和素 (Avidin)、鏈酶親和素 （Streptomyces avidin)。"生物素接受多膚"（biotin accepted p印tide，BAP)為能夠與鐵蛋白N端融合且能夠連接生物素的多肽。"生物素蛋白連接 酶"(Biotin-protein ligase, BirA)是指能夠活化生物素并將生物素連接到生物素受體蛋 白上的酶。
[0064] 本發(fā)明【具體實施方式】、實施例中縮寫ENC可代表酶納米復合物、酶-鐵蛋白納米復 合物、SA-HRP和BAP-rHF結(jié)合產(chǎn)物，具體所代表的含義依據(jù)上下文理解。
[0065] 本發(fā)明【具體實施方式】、實施例中縮寫B(tài)AP-rHF可代表修飾/未修飾生物素的 BAP-rHF、BAP-Linker-rHF，具體所代表的含義依據(jù)上下文理解。
[0066] 實施例1
[0067] 一種酶納米復合物，包括位于核心層的納米顆粒，位于中間層的生物素及位于外 層的親和素修飾的酶；其中所述納米顆粒為由M個相同或同源的亞基通過自組裝形成的球 形納米顆粒，每個納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接M個生物素，所述M > 12,且M為整 數(shù)。
[0068] 酶納米復合物通過可控自組裝制備，具體為通過遺傳修飾制備生物素化的納米顆 粒，將所述生物素化的納米顆粒與親和素修飾的酶混合，其中，所述納米顆粒為由M個相同 或同源的亞基通過自組裝形成的球形納米顆粒，每個納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接 M個生物素，所述M > 12,且M為整數(shù)；通過調(diào)整所述生物素化的納米顆粒與親和素修飾的 酶的比例得到酶納米復合物。在一個具體的實施方式中，當生物素化的納米顆粒與親和素 修飾的酶按物質(zhì)的量比大